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实验方案第一阶段（3~5月，生菜种植）一、研究目的研究不同粪肥（鸡粪、猪粪和有机肥）不同浓度施用对旱地农田土壤生态系统的影响。二、研究内容(1)畜禽粪便污染情况：a)畜禽粪便中抗生素残留及抗性基因污染分析；b)堆肥过程抗生素动态变化；c)堆肥过程中抗性菌及抗性基因（tetG,tetC和sul1等）丰度的变化情况;(2)畜禽粪便施用对农作物的影响a)植物生理生态指标（叶绿素荧光，光合与蒸腾作用等）；b)抗生素在作物中的富集与分布特征；c)畜禽粪便对植物内生菌的影响。(3)畜禽粪便施用对农田土壤的影响：a)不同施肥对土壤营养物质的转化情况和土壤肥力状况（土壤酶活，有机质和氮磷钾等）；b)不同施肥对土壤呼吸，土壤温室气体排放的影响（CO2,N2O，CH4）;c)施肥土壤中的抗生素残留及抗性基因污染情况；d)不同施肥对土壤重金属的影响。(4)畜禽粪便对土壤微生物的影响：a)畜禽粪便施用后农田土壤多样性与结构的变化；b)抗生素抗性细菌和抗性基因的变化；c)根据施肥土壤中nifH基因，AOB和AOA的丰度估算粪肥对土壤N循环的影响；d)通过cbbM,oorA等基因的丰度估算粪肥对微生物固碳作用的影响。三、实验设计试验采用蔬菜土壤，每块样地大小为2m×3m，共计22块样地，132平方米，可根据现场情况调节，具体安排见表1。样地之间设计阻隔,为防止各试验田小区互相渗透，田埂筑高为350mm，并用0.5mm的HDPF防渗膜包裹，交接处焊接，防渗膜埋深0.5m。生菜株行距适宜为20cm。表格1粪肥施用量表粪肥平行样地（2m×3m）施肥量（kg/m2）共计（kg）有机肥133242333465666798999猪粪133242333465666798999鸡粪161082636对照组100共计22117756设计思路：（1）不同粪肥施用对农田土壤生态环境的影响：每种土壤设置4个处理：对照、鸡粪、猪粪、有机肥，3次重复；粪肥施用浓度为3kg/m-2，粪肥全部作为底肥一次性施入.（2）不同粪肥浓度梯度对农田土壤生态系统的影响：有机肥和猪粪土壤分别设置3个浓度梯度：3kg/m2、6kg/m2、9kg/m2，3次重复，粪肥全部作为底肥一次性施入。四、样品采集（1）土壤样品采集使用无菌不锈钢土钻以五点取样法采集500g土壤样品，每个样品分成三部分，其中一部分土样，去除石砾、蚯蚓和植物残体等杂物，然后立即测定土壤含水率；一部分置于室内自然风干，研磨后，分别过10目和100目筛，置于4℃冰箱冷藏，用于测定土壤理化性质；一部分使用无菌袋密封，存放于-20℃冰箱冷冻保存，用于微生物量碳、酶活性和微生物多样性测试。（2）植物样品采集生菜用蒸馏水冲洗后分为两部分（根和叶），然后后用无菌滤纸擦干。用新鲜的叶和根提取植物内生菌。冷冻干燥生菜样品被用来测抗生素含量。取3-5株植株，用去离子水洗净晾干，称其鲜重，称量结束后，带回实验室105度杀青，80度烘干至恒重称其干重。在生菜采收期间阶段性的随机取5株为样品测定，称量其重量，以此估测每个样地产量。五、指标测量表格2测量指标与便携式仪器测量方式指标便携式测量仪器土壤指标现场测量pH，电导率、温度、含水率、土壤呼吸速率、土壤中N2O、CH4浓度等（1）LI-8100A土壤碳通量自动测量系统（2）WET-2土壤水分温度电导率速测仪（3）便携式痕量N2O/CH4土壤通量测定系统（N2OM1-919）非现场测量土壤容重、土壤酶活（过氧化氢酶、土壤蛋白酶和土壤脲酶等）、阳离子交换量，有机质、有机碳、氨氮、硝酸盐氮、全氮、全磷、全钾、氨氮、速效氮磷钾、抗生素和重金属等植物指标现场测量根长、株高、叶片数、叶面积、鲜重、叶绿素荧光（SPAD值）、光合和蒸腾作用（4）LI-6400XT便携式光合作用测量系统（5）FluorPenFP110手持式叶绿素荧光仪非现场测量干重、植株内重金属及抗生素含量，植物内生菌及抗性基因的丰度等微生物指标非现场测量土壤微生物量碳，土壤微生物结构与功能，抗性基因丰度，nifH基因，AOB和AOA的丰度，cbbM,oorA等基因的丰度等现可用便携式设备：（1）LI-8100A土壤碳通量自动测量系统：能够快速自动测量土壤CO2通量（2）WET-2土壤水分温度电导率速测仪：可在野外快速测量土壤的水分、温度、电导率三个重要参数（3）便携式痕量N2O/CH4土壤通量测定系统（N2OM1-919）：可高精度、快速、在线测量土壤中氧化亚氮、甲烷、水汽浓度，可用于开展各类生态系统碳循环及温室气体排放等相关研究（4）LI-6400XT便携式光合作用测量系统：可用于测量植物叶片光合作用和蒸腾作用（5）FluorPenFP110手持式叶绿素荧光仪：可在实验室、温室或野外快速测量植物光合活性测量细则：（1）鲜重：随机取出3-5株叶片和根系完整的生菜样品，用去离子水洗净晾干，测定生菜(地上和地下部)鲜重（2）干重：随机取3-5株植株叶片和根系完整的生菜样品，然后将生菜置于105℃烘箱中杀青1h后，80℃下放置72h，烘干至恒重，测定生菜地上和地下部干重。（3）株高：随机取出10株生菜样品，从植株基部至主茎顶部即主茎生长点之间的距离，测量时将尺子挨着地面量到苗顶最高位置，读数即为株高。（4）容重：rs=g*100/v*(100+W)式中：rs——土壤容重（g/cm3）；G——环刀内湿样重（g）；V——环刀容积（cm3）；W——样品含水量（%）六、采样时间安排第一次采样：生菜种植第0天；第二次采样：生菜种植第15天；第三次采样：生菜种植第30天；第四次采样：生菜种植第45天；第二阶段（6~8月，生菜种植）一、研究目的研究不同浓度生物炭添加对不同粪肥（鸡粪、猪粪和有机肥）施用农田土壤生态系统的影响。二、研究内容(1)生物炭制备的研究(2)生物炭施用对农作物的影响.a)植物生理生态指标（叶绿素荧光，光合作用）；b)生物炭对作物抗生素富集的影响；c)生物炭对植物内生菌的影响。(2)生物炭对农田土壤的影响。a)生物炭添加对土壤营养物质的转化情况和土壤肥力状况（土壤酶活，有机质和氮磷钾等）；b)生物炭添加对土壤呼吸，土壤温室气体排放的影响（CO2,N2O，CH4）;c)生物炭添加土壤中的抗生素残留及抗性基因污染情况；d)生物炭添加对土壤重金属的影响。(3)生物炭添加对土壤微生物的影响。a)生物炭添加后农田土壤多样性与结构的变化；b)生物炭添加后抗生素抗性细菌和抗性基因的变化；c)根据施肥土壤中nifH基因，AOB和AOA的丰度估算生物炭添加对土壤N循环的影响；d)通过cbbM,oorA等基因的丰度估算生物炭添加微生物固碳的影响。三、实验设计试验采用蔬菜土壤，每块样地大小为2m×3m，共计27块样地，162平方米，可根据现场情况调节，具体安排见表3。样地之间设计阻隔,为防止各试验田小区互相渗透，田埂筑高为350mm，并用0.5mm的HDPF防渗膜包裹，交接处焊接，防渗膜埋深0.5m。生菜株行距适宜为20cm。粪肥平行样地（2）施肥量（kg/m2）生物炭添加（kg/m2）粪肥共计(kg)生物炭共计（kg）有机肥160.316221.6260.3360.3460.4560.4660.4760.5860.5960.5猪粪160.316221.6260.3360.3460.4560.4660.4760.5860.5960.5对照组100.3021.6200.3300.3400.4500.4600.4700.5800.5900.5共计2710810.864864.8四、样品采集（同上）五、测量指标（同上）六、时间安排（同上）第三阶段（6~11月，水稻种植）一、研究目的研究不同粪肥（鸡粪、猪粪和有机肥）不同浓度施用对水田农田土壤生态系统的影响。二、研究内容（同第一阶段）三、实验设计（表1）四、采样安排（同上）（1）此外，可增加施肥方式对照，（1）作为底肥一次性施加；（2）以基肥和分蘖肥分两次施用；（3）以基肥、分蘖肥、拔节肥三次施用。（2）多数文献中基肥：分蘖肥：拔节肥的比例为4：3：3或4：4：2。而分两次施用时（基肥：拔节肥）则多以4：6为主。五、测量指标（同上）六、时间安排第一次采样：分蘖期1-20d，第二次采样：拔节期20-40d，第三次采样：齐穗期40-66d，第四次采样：灌浆期66-78d