北肿发补方案最终版

方案编号：NHCIP001-3发补临床试验方案产品名称：人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）包装规格：48测试/盒临床试验类型：■发补临床试验方案版本号和日期：承担临床试验的医疗机构（签章）：北京肿瘤医院主要研究者姓名（签字）：联系电话：统计学负责人（签名）：统计学负责单位（盖章）：北京大学第一医院医学统计室注册申请人（盖章）：天津诺禾致源生物信息科技有限公司注册申请人联系人：张双华联系电话：[phone]一、实验目的根据《人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）》注册审评的发补要求：1）补充待考核试剂盒与已上市荧光PCR试剂盒在检验临床样本时的一致性研究，检验基因包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1。2）补充待考核试剂盒与已经充分联合药物临床评价的伴随诊断试剂作为对比试剂的比对研究临床试验，检验基因（突变）包括EGFR（19del、L858R）、ALK、ROS1。二、待考核试剂盒和对比试剂盒的检测原理、方法：待考核试剂盒基于半导体测序法，针对与非小细胞肺癌靶向治疗密切相关的基因（包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK和ROS1）的多个位点的特异靶序列进行多重PCR扩增，构建文库，混样后进行半导体测序。待考核试剂盒基于半导体测序法，在半导体芯片的微孔中固定DNA链，测序时依次加入A/C/G/T碱基，DNA聚合酶以固定的单链DNA为模板，按碱基互补原理，合成互补的DNA链，并释放氢离子，所释放出的H离子在穿过孔底部时能被检测到，然后通过对所释放H离子的检测，实时判读碱基。如果DNA链含有连续碱基，则记录的电压信号加倍。如果碱基不匹配，则无氢离子释放，也就没有电压信号的变化。这种方法属于直接检测DNA的合成，因少了CCD扫描，荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。运行结束后，利用生物信息学方法将测得序列与参考序列比对，通过数据分析判断靶序列是否发生突变或融合。比对试剂中荧光PCR法试剂盒都采用Taqman荧光PCR，即在扩增时，加入引物的同时加入特异性的荧光探针，该探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。但由于taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，在设计探针时，附加错配突变设计在3’端引物序列中，若出现错配则不会出现扩增，如此引物仅仅识别突变序列，而不识别正常序列。仪器通过检测反应孔中的荧光信号，而达到检测相关已知突变基因型的目的。2／9比对试剂中荧光原位杂交法（FISH法）试剂盒设计了两种探针分别标记ALK基因的两端，300kb的3’端和442kb的5’端分别标记为橘红色和绿色。在无ALK融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色重叠为黄色或者相互粘合（两个信号之间的间隔小于两个信号的直径）；而在存在ALK融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色信号相互分离（间隔≥2个信号直径）。根据荧光信号差异从而判断检测样本中是否存在ALK融合。三、试验设计1、试验机构的选择该验证试验计划在北京肿瘤医院进行。2、参与人员及其职责试验人员职务/职称所在单位科室在试验研究中的职责林冬梅主任医师北京大学肿瘤医院病理科主要研究者，试验方案、报告审核，样本入组，试验指导贾玲技师北京大学肿瘤医院病理科样本准备，试验操作，记录表格填写王萍主管技师北京大学肿瘤医院病理科样本准备，试验操作，CRF表填写王跃技师北京大学肿瘤医院病理科样本准备，试验操作，CRF表填写3、试验样本（1）样本来源根据注册审评发补要求，试验样本为《人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）》临床试验（方案编号：NHCIP001-1；方案版本号和日期：A/02，2016/7/2；临床试验备案号：津械临备20160038）所入组的剩余核酸和新入组回顾性FFPE样本。（2）样本数量的要求研究入组样本例数应符合每个基因阴、阳性都符合统计学的最小样本数的要求。按照阳性符合率和阴性符合率的样本量计算公式：Z1-α/2表示标准正态分布1-α/2的分位数，通常取α=0.05，此时Z1-α/2=1.96；表示精确度，可以根据95%可信区间确定，通常不超过可信区间宽度的一半。22/2-1)1(Zeessn2pp2/2-1)1(Zssn3／9根据上述计算方法，需入组样本总例数约为200例。（3）剩余核酸入选/排除标准：入选标准：1）剩余核酸DNA含量约400ng；RNA总量约600ng，2）患者就诊时确认为晚期或转移性非小细胞肺癌。排除标准：样本发生严重降解，核酸弥散条带的中值在300bp以下。（4）新入组回顾性FFPE样本入选/排除标准：入选标准：1）患者就诊时确认为晚期或转移性非小细胞肺癌；2）临床剩余的石蜡包埋组织切片需大于8张，满足3-5um厚的要求；3）2年以内的石蜡包埋组织切片样本；4）基本信息包括完整的临床确诊资料、性别、年龄、采集日期等；5）HE染色确认样本肿瘤细胞大于30%。排除标准：1）FFPE样本发生严重降解，核酸弥散条带的中值在300bp以下；2）样本提取后DNA含量低于550ng；RNA总量低于1400ng。（5）剩余核酸、新入组回顾性FFPE样本剔除标准：1）试验分析发现的异常值；2）试验登记表信息记录不完整的样本；3）各机构主要研究者所认定的任何其他原因。4、验证试验用待考核试剂盒及对比试剂盒待考核试剂盒名称厂商规格人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）天津诺禾致源生物信息科技有限公司48测试/盒4／9对比试剂盒名称厂商规格注册号试验目的1试验目的21人KRAS基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）北京雅康博生物科技有限公司12测试/盒国食药监械（准）字2013第3400175号√2人BRAF基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）北京雅康博生物科技有限公司24测试/盒国食药监械（准）字2014第3401045号√3人PIK3CA基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）北京雅康博生物科技有限公司24测试/盒国食药监械（准）字2014第3401044号√4人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒（荧光PCR法）厦门艾德生物医药科技股份有限公司12测试/盒国食药监械（准）字2013第3400389号√5人类EGFR基因突变检测试剂盒（蝎形探针ARMS荧光PCR法）QIAGENManchesterLtd24测试/盒国食药监械（进）字2014第3400761号√√6人类ROS1基因融合检测试剂盒（荧光PCR法）厦门艾德生物医药科技股份有限公司12测试/盒国食药监械（准）字2014第3401514号√√7ALK基因重组检测试剂盒（荧光原位杂交法）AbbottMolecular,Inc.20检测/盒国械注进20143405183√上述试剂盒中编号为5、6、7的试剂盒为已经充分联合药物进行临床评价的伴随诊断试剂盒，如下为此三种试剂盒的具体的对应治疗药物信息：名称基因位点对应的NSCLC治疗药物药物上市状态人类EGFR基因突变检测试剂盒（蝎形探针ARMS荧光PCR法）EGFR19delL858R吉非替尼阿法替尼已在中国上市人类ROS1基因融合检测试剂盒（荧光PCR法）ROS1融合克唑替尼已在中国上市ALK基因重组检测试剂盒（荧光原位杂交法）ALK融合克唑替尼已在中国上市5、试验方案根据《人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）》注册审评的发补要求，补充待考核试剂盒在临床样本检测中与已上市荧光PCR检测的一致性评价，以及与已经充分联合药物临床评价的伴随诊断试剂作为对比试剂的比对研究临床试验。本临床试验样本来自北京肿瘤医院注册临床试验时的剩余样本核酸，和5／9新入组的回顾性FFPE样本。按食药监局发布通知要求，所有样本患者来源符合相关药物上市说明书要求。对于剩余核酸，由于待考核试剂盒检测结果已在注册临床试验报告中体现，因此在本次研究中仅需完成对比试剂盒检测。对于新入组的FFPE样本，则需完成待考核试剂盒的检测与对比试剂盒的检测。待考核试剂盒的检测结果将与对比试剂盒检测结果进行对比与统计分析，对不一致样本用对比试剂盒复测三次进行不一致分析。对比试剂盒的流程及结果判读严格按照对比试剂盒说明书；待考核试剂盒的流程严格按照待考核试剂盒的说明书操作，结果判读依据癌症基因数据处理软件完成。四、试验结果评价指标采用待考核试剂盒检测的结果与对比试剂盒检测结果进行一致性对比，预计待考核试剂盒的阳性符合率大于95%，阴性符合率大于95%，即证明待考核试剂盒与荧光PCR试剂盒性能一致；证明待考核试剂盒与已经充分联合药物临床评价的伴随诊断试剂盒临床评价具有一致性。五、统计处理方法1.研究设计本临床试验采用考核试剂检测结果与对比试剂盒检测结果进行同步盲法比较的试验设计类型。2.临床评价指标阳性符合率，及95%置信区间；阴性符合率，及95%置信区间；总体符合率，及95%置信区间；Kappa值；3.统计分析方法（1）一般原则所有的统计检验均采用双侧检验。定量指标的描述将计算均值、标准差、中位数、最小值、最大值，下四分位数（Q1），上四分位数（Q3），分类指标描述各类的例数及百分数。（2）分析指标人口学特征及基本描述对纳入受试者的人口学信息（性别、年龄、病史等）进行描述。定量指标的描述将计6／9算均值、标准差、中位数、最小值、最大值，下四分位数（Q1），上四分位数（Q3），分类指标描述各类的例数及百分数。产品与对比试剂盒检测结果的一致性分析根据试验试剂盒和对比试剂盒检测方法，对所有符合要求的试验数据采用2×2列联表整理，根据下表进行统计分析，并计算相应的评价质保、及总符合率：考核试剂对照试剂合计阳性阴性阳性aba+b阴性cdc+d合计a+cb+dN=a+b+c+d灵敏度=a/(a+c)×100%特异度=d/(b+d)×100%总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%95%置信区间的计算公式：p±1.96×[p(1-p)/n]1/2（其中p为阳性符合率、阴性符合率、总符合率，n为样本数量，若p0.9，则用Wilsonscoremethod进行校正。）Kappa值：根据配对资料四格表，应用SAS9.4或以上版本统计软件计算Kappa值。具体计算公式如下：1accPPKappaP，其中Pa=adN，Pc=()()()()abacbdcdNNNKappa值在0～1之间判断一致性才有意义。Kappa值越大，表示一致性越好。对上述基数资料进行Kappa一致性分析，Kappa系数0.8，为高度一致，认为两系统等效；0.4Kappa系数0.8认为一致，需进行阳性符合率和阴性符合率比较进行统计学分析；Kappa系数0.4则认为两系统不一致，两系统不等效。4.临床试验合格/不合格标准采用McNemar2检验两者检测结果不一致的部分差别是否具有统计学意义(b+c≤40时，采用校正的McNemar2检验，b+c≤20时，视情况采用精确概率法)，同时采用Kappa检验检测两种方法的一致性。两种方法检验统计结果均应无统计学差异；阳性符合率应大于或等于95%同时阴性符合率应大于或等于95%以上，认为两者的一致性好。六、数据管理7／9申办方和研究者将保留有关这项研究的所有记录和文件，他们将可供适当的机构查阅。此外，研究者将保留原始文件，这些记录应被存放在一安全的存储设施中，由临床中心保留，未经申