Western-Blot操作流程

WesternBlot操作流程本人将自己做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。因为每个实验室的条件不一样，所以本流程仅供参考，具体适合自己的实验操作需要大家摸索。由于知识量有限，有些描述用词并不专业，请大家谅解。一、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使用立春红检测是否蛋白是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：小鼠抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：山羊抗小鼠，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影二、物料及配制1、电泳液：一包电泳粉+1000ml双蒸水（可回收使用）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸水3、转膜液：一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收使用）4、TBST溶液：50ml20*TBS+950ml双蒸水+1ml吐温20。（无需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将小鼠抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待用，4度保存。Ⅰ抗（目的蛋白58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待用，4度保存。7、Ⅱ抗（内参）：将山羊抗小鼠：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代用，4度保存。Ⅱ抗（目的蛋白58kDa）：将山羊抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待用，4度保存。7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使用8、定影液：按说明书配制，可长期回收使用9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（一）制胶1、Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制溶液成分成分体积（共约10ml）双蒸水4ml30%丙烯酰胺溶液3.3ml1.5mol/LTris（pH8.8）2.5ml10%SDS0.1ml10%过硫酸氨0.1mlTEMED0.004ml2、Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液溶液成分成分体积（共约5ml）双蒸水3.4ml30%丙烯酰胺溶液0.83ml1.5mol/LTris（pH6.8）0.63ml10%SDS0.05ml10%过硫酸氨0.05mlTEMED0.005ml3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。2）依次将所需试剂加入烧杯中，加入TEMED之后，混匀，用1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的角交替加入分离胶溶液，也可从左到右连续加入（目的：两种方法都可以使液面快速达到水平状态）。溶液加至玻璃板约2/3高度，然后加双蒸水至满或溢出。室温放置约20min，因受温度影响，具体时间以胶凝固并且水平为标准（可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固）。如果胶凝固后未达到水平状态，需重做。3）积层胶溶液的加入同上，使溶液至满或略低，将对应1.00mm规格的梳子嵌入积层胶溶液（同时按压梳子两侧），室温（25度左右）放置约20min，因受温度影响，具体时间以胶凝固并且水平为标（可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固）。注：TEMED的量要严格把握！若配制的胶过早凝固导致液面未达到水平状态，或者长时间不凝固，最可能的原因是加入TEMED时出现了较大误差。天气较冷时（10度左右），凝固时间会延长，可放恒温箱中37度加速凝固。（二）跑胶1、将玻璃板放入电泳槽中，加入适量电泳液（要淹没玻璃板顶部）。在梳子两边同时用力，将其拔出。2、在积层胶最左侧或最右侧的孔中加入4μl的Mark，然后在剩余孔中依次加入10μl蛋白提取液（蓝色）。加入的Mark和蛋白液的量可适当调整。加入时一定要仔细，视线要与孔保持水平，保证所加蛋白提取液全部落入孔中，否则会影响后期含量测定。3、开始跑胶1）将电压调为80V，一直至蓝色接近玻璃板底部停止（约2.5h，分离效果较好）。2）将电压调为80V，当蓝色过了积层胶与分离胶的分界线，可将电压调为110V，一直至蓝色接近玻璃板底部停止（1.5h，分离效果不如上面方法好）。（三）转膜1、将海绵，夹板，滤纸用转膜液润湿。将适量甲醇加入容器中，把PVDF膜（右上角剪出一个小缺口作为标记，其反面为蛋白层）放入甲醇中激活30S，取出放入双蒸水中待用。2、玻璃片取出放于手心，盖玻片（较小的玻璃板）位于上侧，用塑料板（或其它适宜工具）从玻璃板任意一角轻轻撬开。3、Mark的橘红色与70kDa的蛋白相对应，下面依次是55kDa、40kDa、30kDa（内参位于40-55kDa之间）。用塑料板截取所需的蛋白部分，要垂直稍微用力一次截断最好。4、将夹板黑色面朝下，先放一层海绵，三层滤纸，再放胶、PVDF膜，再放三层滤纸，最后再放一层海绵，夹好，颜色相对应放入盒子中，再放入电泳槽中，周围放冰袋，加转膜液淹没夹板。5、开始转膜，电流为150mA，转膜3h。注：PVDF膜尺寸：宽2.5cm，长6.0cm（具体长度根据所加蛋白的孔的长度调节）（四）TBST清洗用镊子将PVDF膜放入TBST中稍快摇动清洗10min，清洗和封闭时蛋白面朝下。（五）封闭放入封闭液，轻摇2h。（六）TBST清洗同上一次。（七）附Ⅰ抗用纸巾将PVDF膜没有蛋白的一面吸干，置于Ⅰ抗溶液中，轻摇30min，放冰箱4度过夜。（八）TBST清洗清洗3次，操作同上。（九）附Ⅱ抗用纸巾将PVDF膜没有蛋白的一面吸干，置于Ⅱ抗溶液中，轻摇1.5h。（十）TBST清洗清洗3次，操作同上。（十一）显影1、准备好定影液和显影液。2、将PVDF膜取出并吸干，放于X射线摄影暗匣的两片塑料薄膜之间，蛋白面朝上，避光，打开红外灯，将显影液倒入适当容器中待用，配制发光液（每一PVDF膜用200μl发光液），用移液枪取200μl发光液（A:B=1：1）均匀铺在PVDF膜上，把上层薄膜放下。3、观察是否有荧光。若当时没出现荧光，则再等待5min，若还是没有，就真没有了，重做实验。若出现荧光，将胶片取出并裁剪适当尺寸，垂直置于PVDF膜上，不可移动。若荧光强烈，持续10S-15S即可；若荧光较弱，则时间稍长。4、将胶片放入显影液中，在红外灯下观察出现影像即可取出，放入定影液中10S即可。5、将胶片、显影液避光保存后才可开灯，实验结束！