生物标志物与分子流行病学

生物标志物与分子流行病学吕嘉春广州医学院学习目标•掌握生物学标志物的概念•掌握生物学标志物的分类•理解生物学标志物的用途•理解在流行病学研究中使用生物学标志物应注意的问题操作目标•在设计应用生物学标志物的流行病学研究时能够做到合理选择标志物•阅读应用生物学标志物的文献时能够分析其合理性什么是生物标志物生物标志物是从生物学介质中可以检测到的细胞、生物化学或分子改变。生物学介质包括各种体液（如血液、尿液）、粪便、组织、细胞、头发、呼气等。为什么要用生物标志物•暴露测量：精确•研究对象选择：减少错分•机体反应：提前发现•个体易感性：•暴露健康损害：有助于阐明机理从暴露到发病的途径暴露内部剂量生物学有效剂量早期反应机体结构/机能改变疾病个体易感性生物标志物的分类•暴露标志物–内部剂量标志物–生物学有效剂量标志物•易感性标志物•效应标志物：机体早期反应与疾病标志内部剂量标志物内部剂量标志物举例标志物暴露生物学介质Cotinine香烟中的尼古丁体液铅环境中的铅体液及组织(如头发、指甲、牙齿)4-A*TNT体液（血液、尿液）DDEDDT脂肪组织黄曲霉毒素食物中的黄曲毒霉素体液致突变实验化学性致突变物体液*4-氨基-2,6-二硝基甲苯内部剂量标志物是在生物材料中测得的暴露物质或暴露物质的代谢产物。生物学有效剂量标志物生物学有效剂量标志物举例标志物暴露生物学介质DNA加合物苯并芘组织、白细胞蛋白质加合物环氧乙烷，TNT红细胞与重要的亚细胞靶结构相互作用的暴露物质剂量即生物学有效剂量。易感性标志物可测得的遗传或获得性因素的指示物。易感性本身不引起疾病，但可影响暴露引发疾病的概率。易感性标志物举例标志物暴露疾病α1抗胰蛋白酶吸烟肺气肿N-乙酰转移酶芳香胺膀胱癌芳香烃羟化酶吸烟肺癌生物学反应标志物生物学反应标志物举例标志物暴露生物学介质染色体致突性化学物质断裂白细胞姊妹染色单体变换白细胞微核粘膜点突变致突性化学物质次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶白细胞胸苷激酶白细胞癌基因活化化学致癌物组织原卟啉升高铅红细胞乙酰胆硷脂酶活性降低有机磷杀虫剂血浆因对暴露反应而引起的靶细胞或组织的生物学改变疾病标志物某些疾病的亚临床期标志物标志物疾病血清α胎儿蛋白肝癌、胃肠疾病、胎儿神经管缺陷癌胚胎抗原胃肠癌、其它胃肠疾病肿瘤相关抗原多种癌症血清谷丙转氨酶心肌梗塞疾病标志物是一生物学或生物化学事件的指示物，它预示着疾病的亚临床期或是疾病自身的一种表现流行病学研究中常用的几种生物标志物•暴露物质本身或其体内代谢产物•染色体改变：如染色体畸变、姊妹染色单体交换、微核等•DNA加合物、蛋白质加合物•各种酶类•基因与癌基因暴露剂量生物学标志物的用途•综合反映多途径暴露•综合反映飘忽不定的暴露•将暴露发生时间同内部剂量联系起来•研究急性暴露与健康结局之间的联系•研究长期暴露与健康结局之间的联系•从混合暴露物中区分出致病性物质•增加对发病机制的认识•估计总的健康危害易感性生物学标志物的用途•估计个体发病危险性•增加对暴露-疾病联系强度估计的精确性•提供发病机理的线索目前研究热点：代谢酶、受体、DNA修复酶基因的多态性与人群的肿瘤易感性研究。早期生物学反应和疾病生物标志物的用途•有助于早期发现健康损害•在建立队列时，将亚临床期疾病病人排除•改进对疾病诱导期、潜伏期的估计•确定暴露发生作用的疾病发展阶段•使疾病的分类更为合理例1、用TNT-Hb加合物估计TNT的暴露剂量•三硝基甲苯(TNT)进入体内途径：呼吸道、消化道、皮肤•暴露剂量因工种、时间而异•传统对暴露的测定方法：环境TNT粉尘浓度，对经消化道和皮肤吸收难以估计•生物检测：血、尿中TNT代谢物测定：反映近期暴露•TNT从各种途径吸收进入血液以后，部分与血红蛋白结合，形成TNT-Hb加合物•TNT-Hb加合物与传统的暴露剂量指标、工种、TNT晶状体白内障有无等相关，表明这加合物能够真实反映暴露水平•TNT-Hb加合物相对稳定(3个月内)•TNT-Hb反映了多途径总的暴露剂量例2、黄曲霉毒素与肝癌关系研究•以往多次流行病学调查表明，食用霉变食物增加肝癌发生的危险性•食物中的黄曲霉毒素含量因季节、地区、因素习惯不同而不同•对个体黄曲霉毒素的摄入量估计困难•缺乏黄曲霉致病的直接证据•队列内病例对照研究：18,000份45-64岁健康男性尿液标本，随访7年，50人发生肝癌。•尿中黄曲霉毒素阳性发生肝癌的危险度RR为3，乙肝表面抗原阳性的危险度RR为7，两者均阳性的危险度为60。可见两种危险因素的作用间有相乘作用。生物标志物的选择•关联性：所选用的生物学标志物应与所研究的暴露-疾病关系有关联•真实性：所选用的暴露标志物应能反映暴露有无及其剂量•可靠性：即可重复性•稳定性：所选用的标志物应相对稳定应用生物学标志物应注意的问题•个体间变异：不同个体同一组织器官中标志物的出现频率和量有可能相差很大•组织间变异：同一个体不同组织器官之间标志物出现的频率和量可能差别较大•测定方法；不同测定方法的灵敏度不同•样本含量：由于测定方法的复杂性或费用问题，样本含量一般较小，因此统计把握度较低流行病学研究设计特点•横断面研究：应用生物学标志物的流行病学研究大多具有横断面的特点•病例-对照研究：实质上也为横断面•病例-病例研究：将某种疾病病例按标志物有无分为两组，比较两组间某些因素的差异•队列内（巢式）病例-对照研究：需要在队列建立时采取并储存生物标本，如血清应用生物学标志物的优点•暴露标志物–对暴露的测定更精确–减少暴露错分•易感性标志物–可筛检出易感个体–估计个体危险性•生物学反应标志物–可发现早期反应–有助于揭示暴露致病机理应用生物学标志物的缺点•有些标志物测定方法复杂、费用昂贵•无法对久远的暴露进行测量•不宜对随时间变动较大的暴露进行测量•样本量一般较小，研究的把握度较小•不易控制多个因素的混杂作用•许多标志物的本质尚不完全明了生物标志物小结•合理选用生物学标志物会增强流行病学在探索暴露-疾病之间关系方面的能力•不加选择地使用生物学标志物并不能提高流行病学研究的质量•传统方式的流行病学调查仍会继续应用分子流行病学定义：利用现代分子生物学原理和技术，从分子乃至基因水平阐明疾病和健康状态的相关生物标志物（或分子事件）在人群中的分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。传统流行病学与分子流行病学传统流行病学：暴露疾病以分布为基础，进行病因推断。分子流行病学的切入点暴露内部剂量生物学有效剂量早期反应机体结构/机能改变疾病易感标志物-------暴露标志-----------效应标志---生物标志物的种类1、暴露标志2、易感标志3、效应标志如何进行工作？1、标志物的筛选：能反映疾病的进程；特异性高、稳定性好；检测方法灵敏、特异、快速方便。2、标本采集与储存：无污染；不变质；标本档案材料要齐全。3、检测技术要合适。（1）DNA水平：PCR、SSCP、测序（2）RNA水平：RT-PCR、NorthernBlot（3）蛋白质水平：WesternBlot、组化（4）功能水平：酶学、机能学4、设计方案的要求：（1）与流行病学研究方法一致。（2）样本种类和样本量的确定。（3）检测指标的选择：要有理论依据；考虑到纵向和横向对比。（4）强调多学科的合作。分子流行病学主要研究方法一、选择生物标志物作为测量指标“暴露---易感----效应”三大类要求：（1）.特异、稳定（2）.标本采集、储存方便（3）.检测方法简便、实用、规范（4）.灵敏度和特异度高二、标本收集与储存建立与检测技术相适应的生物标本库。要求:（1）.无污染。（2）.每个标本都有标识和病例背景。（3）.储存标本在有效期内结果稳定。三、常用分子生物学及相关技术简介1、DNA:Southernblot;PCR;Sequencing.Enzymerestriction;electrophoresis.2、RNA:Northernblot;Dotblot;RT-PCR.3、Protein:Westernblot;Immuno-histochemistry.四、资料分析：1、传统流行病学指标。2、遗传学多态性、杂合度等。3、连锁与分离分析。4、易感性与危险度分析。五、质量控制1、仪器设备的计量校正、正确使用。2、实验试剂的批次不变。3、标本采集和储存能确保其生物性状。4、实验方法统一，操作规范。5、设立多重对照：标准、空白、+、-。6、重复试验。六、研究实例1、应用PCR和测序追踪HIV传染源。某地1名牙医（HIV+）与7名HIV感染者(该牙医治疗过的病人)有无传播关系？同时抽查35名与该牙医无关的HIV感染，取外周血分离单核细胞，经PCR、测序；结果：牙医HIV株与5名其治疗过的病人的HIV同株,其它毒株与牙医株关系较远。2、GSTm1基因多态与潮汕地区食管癌易感性的关系。107例食管癌，111例正常人，外周血提取DNA，进行PCR扩增。无产物为“-”。GSTm1casecontrol-6855+3956合计107111X2=4.34,P=0.0371,OR=1.78(1.01,3.07)研究实例1研究题目波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究测量指标DNA加合物/淋巴细胞DNA（介质）测量方法荧光检测竞争ELISA法、DNA加合物32P后标记技术研究设计横断面分析研究暴露组煤焦油作业工人对照组当地城市居民、近郊农民排除年龄、吸烟、其他职业暴露等因素影响比较3组DNA加合物水平第三节研究方法结果分析当地城市居民（19例）与煤焦沥青作业工人（63例）的DNA加合物水平和谱型相似近郊农民（15例）的DNA加合物水平仅为煤焦油作业工人的1/2或1/3结论环境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可导致体内DNA加合物水平质量控制每份标本同时在不同实验室检测结果一致性好(r=0.66,p0.01)第三节研究方法研究实例2研究题目应用HBV-DNA序列多态性研究HBV的传播测量标志HBV2551-2650位点核酸序列/血清HBV-DNA测量方法ELISA法和PCR法研究设计类病例对照研究（病例病例研究）96名HBeAg阳性儿童和用ELISA检测HBV血清阳性的97名父母假设该位点核酸序列在儿童与父母之间分配是随机的结果分析该序列在儿童和父母之间是非随机分配的（P0.00005)结论HBV具有家庭内传播质量控制关于家庭成员之间1%的序列差异的解释排除了PCR错配可能第三节研究方法返回主菜单