ELISA包被条件

ELISA包被条件将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法,试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。ELISA包被时我们通常使用PH9.6的缓冲液的原因是什么呀，为什么不用中性或酸性的包被液呢。包被缓冲液的选择要依靠你所包被的物质而定,没有绝对的选择,但有一个原则就是要尽可能的保持包被物的活性不被损失.目前常用的包被缓冲液有PBS,CBS,tris盐缓冲液,咪脞缓冲液等,一般来说,缓冲液的pH要大于蛋白质的pI,以保持其活性.碱性包被液如碳缓用的较多，尤其是在小分子和载体蛋白的偶联物的包被，其主要的优势在于碱性环境可以使蛋白更容易的与板子结合。也有用PBS和柠檬酸缓的，但是比较少见，碳缓效果很好，又易于配置，所以CC用的最多啊！为什么缓冲液的PH大于蛋白的PI包被效果好呢，跟蛋白的带电荷情况有没有关系，蛋白和聚苯乙烯板子结合的详细过程目前上不是很明了，目前认为是通过静电吸附在板子上的，而聚苯乙烯板子一般在出厂前也要经过强电厂处理以提高吸附能力！肯定和蛋白的带电情况有关，包被缓冲液并不一定都是PH9.6的CB，不同的蛋白选用不同的包被缓冲液可以得最佳的包被效果，从上面可以看出和蛋白的带电情况有明显的相关性！为什么缓冲液的PH要大于包被蛋白的PI，原因有两点：一是因为蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附。而缓冲液的PH略大于包被蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。二是因为酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，而缓冲液的PH略大于包被蛋白的PI，可以使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提高包被效率。所以我们常用的包被液体多位PH9.6的碳酸氢钠缓冲液，当然对PI低的蛋白质也有使用PH7.4的包被液的情况。楼上两位解释得很清楚，学习了!最重要的原因：防止蛋白和蛋白的吸附