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课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O二、研究思路（一）筛选菌株提出的问题—如何寻找耐高温的酶？解决问题的思路—寻找耐高温环境；原理—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。实验室中微生物的筛选原理?人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。（一）筛选菌株KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。（一）筛选菌株1、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2、菌株：纯且活状态所保存的菌种。（二）统计菌落数目：1、活体计数法（稀释涂布平板）（1）操作方法：稀释涂布平板→统计菌落数（2）原理：1个菌落→1个活菌（3）统计原则①选30∼300个菌落的平板统计②每个稀释度取3个平板取其平均值为什么？例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值（二）统计菌落数目1、活菌计数法（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目_____，因此统计结果一般用菌落数表示。为什么？每克样品中的菌株数=（C/V)*MC:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数低2、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。（二）统计菌落数目不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。（三）设置对照对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。浅谈生物学实验中对照实验的类型“对照原则”是中学生物实验设计中最常用的原则，通过设置对照实验，既可排除无关变量的影响，又可增加实验结果的可信度和说服力。一个实验可包括实验组和对照组，实验组是接受实验变量处理的对象组，所处理的变量就是我们要研究的内容；对照组，也称控制组，是不接受实验变量处理的对象组。按对照的内容和形式上的不同，常用的对照类型有空白对照、自身对照、相互对照、条件对照、配对对照、标准对照、阳性对照、阴性对照、安慰剂对照等9种类型。1空白对照空白对照指不做任何实验实验的对照组或不给对照组以任何处理因素。值得注意的是，不给对照组任何处理因素是相对实验组而言的，实际上对照组还是要做一定的处理，只是不加实验组的处理因素，或者说相对于实验组而言，除实验变量外，别的处理与实验组完全相同。空白对照能明白地对比和衬托实验组的变化和结果，增加说服力。通常未经实验因素处理的对象组为对照组，经实验因素处理的对象组为实验组；或处于正常情况下的对象组为对照组，未处于正常情况下的对象组为实验组。例如，在“生物组织中可溶性还原糖的鉴定”的实验中，向甲试管溶液加入试剂，而乙试管溶液不加试剂（零剂量），一起进行温水浴加热，比较它们的变化。这样，甲为实验组，乙为对照组，且乙为典型的空白对照。空白对照能明白地对比和衬托出实验组的变化和结果，增强了说服力。例题剖析：有人设计实验探究有机肥是否能提高土壤肥力并优于化肥。实验分为两组，一组农田施有机肥，一组农田施化肥。该实验设计缺少（）A．施用有机肥和适量化肥的对照田B．既不施用有机肥也不施用化肥的对照田C．施用大量化肥和少量有机肥的对照田D．施用少量化肥和大量有机肥的对照田解析：本题考查是否具有对一些生物学问题进行初步探究的能力。本题的实验目的有两个，一是探究有机肥是否能提高土壤肥力，二是探究有机肥的肥力是否优于化肥。就实验目的一而言，施用有机肥的农田只有与既不施用有机肥也不施用化肥的农田作对照，才能说明有机肥是否能提高土壤肥力。答案：BB2自身对照自身对照指对照组和实验组都在同一研究对象上进行，不另设对照。自身对照方法简便，关键是看清实验处理前后现象变化的差异。实验处理前的对象状况为对照组，实验处理后的对象变化则为实验组。如“观察植物细胞的质壁分离和复原”实验，就出现了两次对照，其中第一次对照是在高浓度溶液处理下，质壁分离状态与自然状态形成对照；第二次对照是在低浓度溶液处理下，复原后状态与质壁分离状态形成对照。又如：要研究植物根具有向重力性，茎具有背重力性，可把某一植株横放于培养基上，让其自然生长，经过一段时间后，便可观察到根向重力生长，茎背重力生长。这里，对照和实验都在同一个体上进行，属于自身对照。3相互对照相互对照是指不单独设对照组，而是几个实验组相互对比对照，其中每一组既是实验组也是其他级别的对照组，由此得出相应的实验结论。一般是在探究某种实验因素对实验结果的影响不明确的情况下使用，通过实验的相互对比，确立实验变量和反应变量的关系。在等组实验法中，若不设空白对照，则大都是运用相互对照。相互对照较好地平衡和抵消了无关变量的影响，使实验结果具有说服力。例如，“植物的向性运动”的等组实验中，5个实验组采用的都是相互对照，较好的平衡和抵消了无关变量的影响，使实验结果更具有说服力。又如“验证植物根对矿质离子有选择吸收的特性”，可把番茄和水稻分别培养在成分相同的培养液中，过一段时间后，测定培养液中各种矿质元素离子浓度的变化，就会发现番茄吸收Ca多，吸收Si少；而水稻吸收Si多，吸收Ca少。以上就是两个实验组的相互对照。再如，在“探究酵母菌细胞呼吸的方式”的实验中，需要设置有氧和无氧两个条件，探究酵母菌在不同氧气条件下细胞呼吸的方式，这两个实验组的结果都是事先未知的，通过对比可以看出氧气条件对细胞呼吸的影响。典型分析：温度对唾液淀粉酶活性的影响实验（1）实验对象：加了相同淀粉糊的四支试管。（2）对照处理：不另设对照组，而是将四支试管分别放在温度为80℃、60℃、37℃、0℃的不同环境中，并同时逐个加入相同的唾液。（3）实验结果：对相同时间内四组溶液中淀粉糊消化程度进行检测，并记录检测值。（4）对照分析：通过对四组检测值之间相互对比，得出淀粉糊消化程度最高组的温度，即为本探究实验的唾液淀粉酶活性的最适温度。4条件对照条件对照是指虽给对象施以某种实验处理，但这种处理是作为对照意义的，给定的处理因素正是为了保证实验中对照组与实验组相比只是少了实验变量的影响，或者说这种处理不是实验假设所给定的实验变量意义的。通常施以条件因素的对象组为对照组，施以实验因素的对象组为实验组。例如，在艾弗里证明DNA是遗传物质的实验中，实验组是“R型活细菌＋S型细菌的DNA混合培养”，条件对照组是“R型或细菌＋S型细菌的DNA和DNA酶混合培养”。再如，“验证甲状腺激素促进幼小动物发育”的实验中，采用等组实验法，其实验设计方案是：以蝌蚪为实验材料，甲组（实验组）饲喂甲状腺激素；乙组（条件对照组）饲喂甲状腺抑制剂；丙组（空白对照组）对蝌蚪不做任何处理。通过比较、对照、更能充分说明实验变量──甲状腺激素有促进动物生长发育的作用。条件对照的目的是通过对比得出相对立的结论，以验证实验结论的正确性。例题剖析：某校生物兴趣小组将体重、大小和年龄相同的成年小鼠分成甲、乙、丙三组，分别进行如下表所示的两步连续实验，下列有关该实验的叙述错误的是：A．该实验可验证胰岛素和胰高血糖素的功能以及它们在调节血糖过程中的拮抗作用B．该实验的对照有同组内的自身对照、甲乙间的相互对照，设计丙组作空白对照无必要C．该实验所用的胰岛素溶液和胰高血糖素溶液应是生理盐水与相应激素配制而成D．该实验同一步所用的三种溶液用量必须相等，同一组前后两步所用溶液用量可以不等解析：该实验通过甲组和乙组的自身对照，可验证胰岛素和胰高血糖素的功能以及它们在调节血糖过程中的拮抗作用。实验要严格遵循对照原则和单一变量原则，因此该实验所用的胰岛素溶液和胰高血糖素溶液应是生理盐水与相应激素配制而成，而且该实验同一步所用的三种溶液用量必须相等，同一组前后两步所用溶液用量可以不等。该实验有组内的自身对照（第一步与第二步对照），也有甲乙两组的相互对照，但是丙组的空白对照也很有必要，因为只有与空白对照相比较才能够看出实验组的情况是否异常。答案：B四、实验过程（一）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养（二）样品稀释（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液◆分离不同的微生物采用不同的稀释度?原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板（三）微生物的培养与观察1、接种：用适当的稀释液作涂布平板2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d;放线菌:25∼28℃,5∼7d;霉菌:25∼28℃,3∼4d.3、观察：a.每24h统计一次菌落数目b.以“稳定菌落”为观察对象◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行样品的稀释取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。微生物的培养与观察关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四.课外延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性