苹果酸-乳酸发酵

葡萄酒工艺学5.苹果酸-乳酸发酵5苹果酸－乳酸发酵(MLF)本章主要讲述苹果酸－乳酸发酵的机理、作用、控制技术和工艺条件。要求学生了解苹果酸－乳酸发酵的机理、作用和研究进展，掌握现代葡萄酒酿造的基本原理，掌握苹果酸－乳酸发酵对干红葡萄酒的必要性及其控制技术和工艺条件。教学重点和难点：苹果酸－乳酸发酵的管理和控制。5苹果酸－乳酸发酵(MLF)5.1MLF的简史和定义5.2MLF的意义5.3MLF的机理5.4苹果酸－乳酸细菌的种类和特性5.5如何进行MLF5.6MLF的新技术思考题5.1MLF的简史和定义定义：就是在乳酸细菌的作用下将苹果酸分解为乳酸和CO2的过程。使酸涩、粗糙柔软肥硕，提高酒的质量。18世纪70年代，巴斯德首先发现。1914年，瑞士Muller－Thurgau等定名为苹果酸－乳酸发酵。现代葡萄酒学的研究得出现代葡萄酒酿造的基本原理——要获得优质的干红葡萄酒，首先应该使糖和苹果酸分别只被酵母菌和MLB分解；其次应尽快完成这一分解过程；第三，当葡萄酒中不再含有糖和苹果酸(而且仅仅在这个时候)，葡萄酒才算真正生成，应尽快除去微生物。5.2MLF对葡萄酒质量的影响苹果酸-乳酸发酵对酒质的影响受乳酸菌发酵特性、生态条件、葡萄品种、葡萄酒类型以及工艺条件等多种因素的制约。如果苹果酸-乳酸发酵进行的纯正，对提高酒质有重要意义，但乳酸菌也可能引起葡萄酒病害，使之败坏。1．降酸作用在较寒冷地区，葡萄酒的总酸尤其是苹果酸的含量可能很高，苹果酸-乳酸发酵就成为理想的降酸方法，苹果酸-乳酸发酵是乳酸菌以L-苹果酸为底物，在苹果酸-乳酸酶催化下转变成L-乳酸和CO2的过程。二元酸向一元酸的转化使葡萄酒总酸下降，酸涩感降低。酸降幅度取决于葡萄酒中苹果酸的含量及其与酒石酸的比例。通常，苹果酸-乳酸发酵可使总酸下降1-3g/L。2.增加细菌学稳定性苹果酸和酒石酸是葡萄酒中两大固定酸。与酒石酸相比，苹果酸为生理代谢活跃物质，易被微生物分解利用，在葡萄酒酿造学上，被认为是一种起关键作用的酸。通常的化学降酸只能除去酒石酸，较大幅度的化学降酸对葡萄酒口感的影响非常显着，甚至超过了总酸本身对葡萄酒质量的影响。而葡萄酒进行苹果酸-乳酸发酵可使苹果酸分解，苹果酸-乳酸发酵完成后，经过抑菌、除菌处理，使葡萄酒细菌学稳定性增加，从而可以避免在贮存过程中和装瓶后可能发生的二次发酵。3．风味修饰苹果酸-乳酸发酵另一个重要作用就是对葡萄酒风味的影响。例如乳酸菌能分解酒中的柠檬酸生成乙酸、双乙酰及其衍生物（乙偶姻、2,3-丁二醇）等风味物质。乳酸菌的代谢活动改变了葡萄酒中醛类、酯类、氨基酸、其它有机酸和维生素等微量成分的浓度及呈香物质的含量。这些物质的含量如果在阈值内，对酒的风味有修饰作用，并有利于葡萄酒风味复杂性的形成；但超过了阈值，就可能使葡萄酒产生泡菜味、奶油味、奶酪味、干果味等异味。其中，双乙酰对葡萄酒的风味影响很大，当其含量小于4mg/L时对风味有修饰作用，而高浓度的双乙酰则表现出明显的奶油味。苹果酸-乳酸发酵后有些脂肪酸和酯的含量也发生变化，其中乙酸乙酯和丁二酸二乙酯的含量增加。4．降低色度在苹果酸-乳酸发酵过程中，由于葡萄酒总酸下降（1-3g），引起葡萄酒的pH上升（约0.3个单位），这导致葡萄酒的色密度（colorintensity）由紫红向蓝色色调转变。此外，乳酸菌利用了与SO2结合的物质（α-酮戊二酸，丙酮酸等酮酸），释放出游离SO2，后者与花色苷结合，也能降低了酒的色密度，在有些情况下苹果酸-乳酸发酵后，色密度能下降30%左右。因此，苹果酸-乳酸发酵可以使葡萄酒的颜色变得老熟（张春晖等，1999）。5．细菌可能引起的葡萄酒病害在含糖量很低的干红和一些干白葡萄酒中，苹果酸是最易被乳酸菌降解的物质，尤其是在pH较高（3.5-3.8）、温度较高（＞16℃）、SO2浓度过低或苹果酸-乳酸发酵完成后不立即采取终止措施，几乎所有的乳酸菌都可变为病原菌，从而引起葡萄酒病害。根据底物来源可将乳酸菌病害分为：酒石酸发酵病（或泛浑病）；甘油发酵（可能生成丙烯醛）病（或苦败病）；葡萄酒中糖的乳酸发酵（或乳酸性酸败）。MLF的影响因素MLF依赖于：良好的酵母发酵良好的葡萄酒MLFMLB的种类，MLF后微生物群落的活动MLF的环境条件酒厂的卫生，SO2的使用，过滤可能与酵母代谢相互作用，接种时间影响风味MLF适用的酒种适用的酒种：对于干红很重要；对于酒体丰满的霞多丽(木桶)、赛美容、灰比诺、缩味浓、沙斯拉干白，从MLF中获益非浅；适于高酸果香型酒，起泡葡萄酒基酒。MLF逐渐成为改善酒体，使香气、风味物质平衡的必需程序，而且在严格工艺控制的条件下可以实现降酸至酿酒者需要的任意酸度，并得到良好的风味和口感。5.3MLF的机理发酵一般是厌氧获得能量的反应，而MLF的能量来自少量糖的分解0.1g-5g苹果酸，MLF的目的或许是改善自身的生存环境，目前还不清楚。由苹果酸转化为乳酸，有3条可能的途径：苹果-酸-草酰乙酸-丙酮酸-乳酸；苹果酸-丙酮酸-乳酸；苹果酸-乳酸。如果有丙酮酸环节，MLB又具有两种脱氢酶，葡萄酒中就应该有L和D型两种乳酸，而实际上MLF只是将酒中L苹果酸转化为L乳酸，所以只能是第三条途径，将催化该反应的酶命名为苹果酸－乳酸酶(MLE)。苹果酸－乳酸酶（MLE）的性质为诱导酶，即只有当基质中含有苹果酸时，乳酸菌才能合成此酶；其活性需要NAD+为辅酶，故其具有与苹果酸脱氢酶和苹果酸酶相似的性质；它只能将L-苹果酸转化为L-乳酸；其分子量很大，为230000左右。最佳活动pH值为5.75，需要Mn2+的激活。L-乳酸和其它有机酸都对MLE有抑制作用，更有研究表明，有机酸对细菌的抑制作用比对MLE更为强烈。作用机理的假说：MLE是多个蛋白酶构成的复合体，其中一部分像苹果酸酶一样催化L-苹果酸转化为丙酮酸，另一部分则像L-乳酸脱氢酶一样将丙酮酸转化为L-乳酸，但是，丙酮酸和NAD+并不被复合体释放。5.4苹果酸－乳酸细菌的种类和特性5.4.1MLB的种类5.4.2影响MLB的因素5.4.3MLB的生长周期5.4.1MLB的种类引起MLF的乳酸细菌分属于明串珠菌属、乳杆菌属、片球菌属和链球菌属。葡萄酒中的MLB多为异型乳酸发酵细菌。明串珠菌属的酒明串珠菌能耐较低的pH，较高的SO2和酒精，是MLF的主要启动者和完成者。后经深入研究发现，该种与同属的其它种在表型和遗传型上有明显差异，1995年Dicks将其重新命名为酒球菌属，酒类酒球菌。按照乳酸菌对糖代谢途径和产物种类的差异，分为同型和异型乳酸发酵细菌。异型乳酸发酵指葡萄糖经发酵后产生乳酸、乙醇(或乙酸)和CO2等多种产物的发酵；同型乳酸发酵指产物中只有乳酸和CO2的发酵。5.4.2影响MLB的因素1/3酒精：2-4%轻微促进，12％对一般乳酸菌的前期增长有强烈抑制作用，对酒精的耐受力：酒类酒球菌12％，片球菌14％，乳杆菌15％，温度高、pH低时耐力下降。SO2：对MLB有强烈抑制。10-25mg/L对MLB群体生长影响不大，大于50mg/L则明显推迟或不能进行MLF，低pH同SO2有协同作用。当Tso2100mg/L或结合SO250mg/L或Fso210mg/L就可抑制MLB繁殖，使之不能达到MLF需要的菌数，当MLF结束用10-25mg/LSO2阻碍MLB的活动。pH：pH≤3.0几乎所有MLB受抑制，pH3-5期间，随pH升高，MLF速度加快。一般乳酸菌最适pH为4.8，低于3.5MLF难发生，酒类酒球菌能耐低pH。5.4.2影响MLB的因素2/3温度：最适生长温度因菌种而异，10℃抑制生长，15℃生长缓慢，15-30℃随温度升高，MLF加快，结束也早，温度高会带来一些缺陷，18-20℃最佳。致死温度60℃(1-2min)。CO2和02：CO2对MLF有促进作用，AF后晚除渣有利于保存CO2。MLB为兼性厌氧菌，生存需要低浓度的氧，太多的氧则抑制。品种：红葡萄中含有比白葡萄多的促进MLB生长的物质，红葡萄酒比白葡萄酒易发生MLF。品种间也不同。工艺：影响MLB数量、活性、营养物质的处理都影响MLF。果皮上有营养物质(浸渍强度)，酵母自溶，冷、热处理，过滤、离心等。5.4.2影响MLB的因素3/3抑菌剂：SO2、山梨酸、多酚、氯霉素、溶菌酶、脂肪酸等其它微生物：酿酒酵母的某些菌株对生长有拮抗，污染了膜蹼毕赤氏酵母、路德类酵母的葡萄酿造的酒对MLB生长有抑制，能分泌核苷酸等营养物质的某些酵母促进MLB生长，污染过灰葡萄孢和醋酸菌的葡萄酿造的酒能促进MLB生长。菌种间相互影响，噬菌体能侵染MLB，使MLF延缓停止。发酵罐的大小、高度、使用木桶或钢罐也产生影响。P75图5-3用实验证明了SO2、温度(19、14℃)、AF对MLB群体的影响。5.4.3乳酸菌的生长周期在葡萄酒酿造过程中，MLB的生长周期分为：潜伏阶段：AF过程，选择保留了最适应葡萄酒环境的MLB群体。繁殖阶段：AF结束后，MLB大量繁殖，群体数量达到最大值。分解苹果酸，几乎不生成醋酸。平衡阶段：群体数量几乎处于平衡稳定状态，条件适宜可持续很长时间。分解葡萄酒几乎其它所有的成分，造成挥发酸的升高，引起葡萄酒各种病害。实验证明了：苹果酸在繁殖阶段被分解；不管基质中是否有苹果酸，繁殖阶段生成的醋酸很少；醋酸主要在平衡阶段生成，与基质的含糖量成正比。因此，一旦苹果酸消失，应立即杀死或去掉MLB。5.5如何进行MLF1/3酒样、菌种、接种(菌种活化、量、时间)、监控管理、判断终点、中止。酒样：AF前SO2≤70mg/L，若≤50mg/L更佳，AF后不使用SO2，酒度≤12％，S≤4g/L，pH≥3.2，温度18-20℃，密闭满罐，必要时带酒脚，加酵母菌皮(吸附脂肪酸)。菌种：对环境的适应性(pH、温度、酒度、SO2)，抗噬菌体，不同菌系、不同菌类混合培养，酒质(色香味)。接种：以接种纯种MLB为好，也有自然促发MLF的(组胺高)。有少数菌种直接用于酒中，多数需预先水化复活，介质有水、汁-水、酒-水-汁，甚至可以扩培。5.5如何进行MLF2/3接种量：接种后MLB群体数量达到106/ml。接种量与MLF速度(可控性)有很大关系，与挥发酸有关，太小的接种量挥发酸高。5.5如何进行MLF3/3接种时间：最好在AF后；若同时进行AF和MLF，即在AF前接种MLB，需要解决微生物间的拮抗和对底物的专一性(单一发酵性)，而且某一发酵出现问题时，所采取的措施可能影响到另一发酵，需要强的抗SO2能力。据报道有能用于葡萄汁或正在AF的葡萄醪的乳酸菌，效果好。监控管理：纸层析、HPLC、酶法测D乳酸、观察气体的溢出、变浑浊及感官变化、监测挥发酸、很少数用镜检方法。终点判断：纸层析苹果酸消失，有时不能灵敏地指示MLF是否完成，因琥珀酸和乳酸，柠檬酸和苹果酸的斑点很近，有时难以区分；苹果酸200mg/L；D乳酸200mg/L，认为MLF结束。中止：立即分离转罐并使用20-50mg/LSO2处理。5.6MLF的新技术60年代，固定MLB可使苹果酸转化达51.2-53.9%；也进行了固定MLE的工作，但操作要求较高，而前者效果不错，使得固定MLE的研究减少。85年转MLE基因酵母，只是表达差，一直20%；现在认为表达差的原因是缺少通透酶，裂殖酵母中有苹果酸通透酶，希望将MLE和通透酶基因都转到酵母中，可能解决表达差的问题。学院已经研究了乳酸菌的固定化；从各个葡萄酒产区分离、纯化、筛选乳酸菌，研究我国的乳酸菌资源，其中有活性好、发酵酒质好的菌株正研制其干粉。了解生物技术在MLF中的应用，提供一种思路。思考题MLF及其对葡萄酒质量的影响？现代干红葡萄酒酿造的基本原理如何进行MLF(人工接种、自然)？