4-中药制剂分析-含量测定详解

（AnalysisofChinesePreparation）中药学衔接班第四章中药制剂的含量测定1了解中药制剂分析的样品测定处理方法2熟悉含量测定的方法学考察3掌握中药制剂常用定量分析方法的运用学习目的：反映其制剂中有效成分或者毒性成分的含量衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣样品处理的主要作用释放被测组分，制成稳定试样除去杂质，纯化浓缩试样形式符合测定的要求样品处理的主要步骤1.样品的粉碎2.样品的提取3.样品的分离纯化样品的粉碎目的——1.取样均匀2.提取完全粉碎设备——粉碎机、研钵、匀浆机※粒度大小合适样品粉末的分级（过筛）※防止污染或损失仪器设备洁净粉尘和较大颗粒的损失。样品的提取关键——提取完全溶剂的选择水、酸水、碱水亲水性的有机溶剂：乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮亲脂性的有机溶剂：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷样品的提取冷浸法：部分测定法（溶剂易挥发）全部测定法（残渣需洗涤完全）优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少缺点：费时（12-24h）费溶剂（10-50倍）样品的提取回流提取法连续回流提取法万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定+HCl-70%乙醇溶液，加热回流1h保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定+甲醇，加热回流至提取液无色为止样品的提取超声提取法原理：超声波的助溶作用优点：操作简便，提取速度快※需对超声频率、提取时间、提取溶媒等进行考察※超声波可能引起供试品成分的改变样品的提取超临界流体提取法（Supercritical-fluidextraction，SFE）超临界流体——特殊的物质状态密度-d液体→溶解能力强粘度-气体→传质快，有利于待测组分的扩散表面张力几乎为0→浸润性能好样品的提取超临界流体提取法密度受压力、温度的影响大→改变对溶质的溶解能力加入甲醇、氯仿、苯等改变极性→提取不同极性的成分优点：速度快、萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，而且可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光谱等分析仪器直接联用。样品的分离纯化沉淀法复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。蛇胆糖浆口服液含有大量糖，可用无水乙醇回流样品，冷后过滤，除糖以消除其干扰。样品的分离纯化蒸馏法适用于具挥发性的待测组分，如挥发油、小分子的生物碱、丹皮酚等最常用水蒸气蒸馏法共水蒸馏法通水蒸气蒸馏法水上蒸馏法利用盐析作用，提高蒸馏效果样品的分离纯化液-液萃取法直接萃取法萃取剂的选择亲脂性有机溶剂：如苯、氯仿或乙醚弱亲脂性的溶剂：如乙酸乙酯、正丁醇等多次萃取（3-4次）调整水相酸度，提取有机酸、有机碱利用盐析作用，提高提取率样品的分离纯化液-液萃取法离子对萃取法BH+（水相）+In-(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有机相）适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取※水相酸度的控制※离子对试剂的选择样品的分离纯化色谱法（层析法）分离的原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱装柱方法：湿法装柱、干法装柱微柱色谱（固相萃取）样品的分离纯化色谱法（层析法）硅胶：酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析，强烈保留碱性化合物。洗脱顺序：极性小→大氧化铝：带有碱性，分离一些碱性中草药成分，不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离中性氧化铝、酸性氧化铝：适用于酸性成分的分离样品的分离纯化色谱法（层析法）键合相硅胶（C18或ODS）：分开脂溶性和水溶性成分操作程序：①柱的活化；②上样；③清洗；④洗脱。洗脱顺序：极性大→小样品的分离纯化色谱法（层析法）大孔树脂分为极性（丙烯酰胺聚合物）和非极性（苯乙烯和二乙烯苯的共聚物）型非极性型（XAD-2等）：分开脂溶性和水溶性成分※使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗样品的分离纯化色谱法（层析法）聚酰胺：与溶质形成氢键而产生吸附作用，常用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离。硅藻土、纤维素：以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相的分配色谱洗脱顺序：极性小→大样品的分离纯化色谱法（层析法）离子交换树脂：用于除去样品中的离子及萃取可离解化合物(弱酸、弱碱药物)活性炭：非极性吸附剂使用前需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥分开水溶性芳香族物质与脂肪族物质，单糖与多糖，氨基酸与多肽样品的分离纯化固相微萃取（SPME）集萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新方法样品的分离纯化消化法——测定中药制剂中的无机元素湿法消化硝酸—高氯酸法：适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏※对含氮杂环类有机物破坏不够完全。硝酸—硫酸法※与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。硫酸—硫酸盐法：常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。样品的分离纯化消化法——测定中药制剂中的无机元素湿法消化硫酸—硫酸盐法：常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。干法消化供试品灰分※控制温度在420℃以下※不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。灼烧灰化(+NaCO3/MgO)方法学考察提取条件的考察测定方法与条件的选择定量分析方法验证定量分析方法验证准确度、精密度线性与范围专属性、检测限、定量限耐用性准确度准确度的高低用误差大小表示。是指以测得结果与真实值之间的接近程度。常用回收率试验来表示。（加样回收率）A为供试品所含被测成分量B加入对照品量C为实际测得值%100BA-C回收率准确度准确度的要求线性范围内进行操作回收率要求中药制剂95%-105%回收率的RSD≤3%对于制剂过程复杂回收率不得小于90%生物样品分析85%-115回收率的RSD≤5%精密度表示在相同条件下,同一试样的重复测定值间的符合程度。精密度高低常用S或RSD表示。标准偏差相对标准偏差11i2inXXSn%100XSRSD精密度1.重复性同一浓度样品6次，进行评价。不同浓度3个，每个样品3次，进行评价。2.中间精密度考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。（同一实验室）精密度3.重现性不同实验室不同分析人员测定结果的精密度采用法定标准分析方法时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时重现性结果均应记载在起草说明中。4.数据要求报告S、RSD。专属性是指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确，专一地测定分析物的能力。线性范围耐用性重量分析法：挥发法、萃取法和沉淀法酸碱滴定法滴定分析法沉淀滴定法配位滴定法氧化还原滴定法化学分析法适用于含量较高的成分及无机成分的测定化学分析法重量分析挥发法：如水分测定萃取法：如冰片散中冰片的含量测定沉淀法：如苦参片中苦参总碱的含量测定化学分析法滴定分析酸碱滴定法：测定生物碱、有机酸、内酯类沉淀滴定法银量法：生物碱的氢卤酸盐及有机卤化物四苯硼钠法：+生物碱→白色沉淀亚铁氰化钾法化学分析法滴定分析配位滴定法（EDTA法和硫氰酸铵法）：测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量氧化还原滴定法：酚类、糖类及矿物药中Fe、As等紫外－可见分光光度法紫外－可见分光光度法吸收系数法A=ECL对照品比照法对照品溶液浓度应与供试品浓度接近（100±10％）计算分光光度法等吸收点法，系数倍率法，三波长法，导数光谱法紫外－可见分光光度法吸收系数法根据Beer定律A=εcl，若l和吸光系数ε或已知，即可根据测得的A求出被测物的浓度。例:小檗碱溶液在345nm处的为728，现测的某小檗碱溶液在345nm出的吸收度为0.5824，计算该小檗碱溶液的浓度。%11cmElEAClACcm%11或%11cmE紫外－可见分光光度法工作曲线法从标准品吸光度-浓度曲线求得样品溶液的浓度。KCAKCA或紫外－可见分光光度法工作曲线法标准曲线的制备精密量取对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别置10mL量瓶中，各加50%甲醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4mL，再加50%甲醇至刻度，摇匀。以相应的溶液为空白。照紫外-可见分光光度法（附录VA），在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。紫外－可见分光光度法对照品对照法对照品溶液浓度应与供试品浓度接近（100±10％）在一定线性范围内根据Lambert-Beer定律溶液的浓度和吸光度存在以下关系样标样标CCAA对照品对照法例1：某种药制剂中有效成分的365nm=766，在相同条件下分析某厂生产的该制剂的365nm=759，试计算其含量。例2：水苏碱在510nm处有最大吸收，现用标准品制的0.002%的水苏碱标准溶液,A510nm=0.502，某水苏碱供试品溶液在相同条件下测的A510nm=0.626，试计算该供试品溶液中水苏碱的含量。%11cmE%11cmE对照品对照法例:急支糖浆中麻黄碱的含量测定标准液的配制：精密量取麻黄碱对照液（0.1mg/ml）2.5mL置分液漏斗中，精密加入缓冲液25ml，再精密加入氯仿25mL和溴麝香草酚蓝染料2.5mL，摇匀，分层。取氯仿层，即得。样品液的制备：精密量取急支糖浆2.5mL置分液漏斗中，精密加入缓冲液25ml，再精密加入氯仿25mL和溴麝香草酚蓝染料2.5mL，摇匀，分层。取氯仿层，即得。在410nm处测定六次取平均值，得A样=0.428，A标=0.385，试计算本品中麻黄碱的含量。紫外－可见分光光度法计算分光光度法双波长分光光度法（等吸收点法、系数倍率发）三波长法导数光谱法一般应用于供试品溶液中含有2中或2种以上的组分的含量测定。差示光谱法利用比样品浓度稍低的标准品作为空白,进行测定及计算的方法.紫外－可见分光光度法计算分光光度法应用实例：银黄口服液由金银花和黄芩的提取物组成，其主要成分绿原酸和黄芩苷在紫外区均有吸收，且吸收峰相互重叠干扰，经测定绿原酸在278nm和322nm处有等吸收点，且黄芩苷在278nm处有最大吸收。现测的某银黄口服液A278nm=0.621，A322nm=0.315，黄芩苷278nm=631.20，322nm=368.40。试计算该银黄口服液的黄芩苷的含量。%11cmE%11cmE紫外－可见分光光度法应用实例：差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量1.胆红素具有高度共轭体系结构，在波长453nm处为最大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在453nm处吸收度显著降低。2.选用日光下照射30分钟或在红外灯下照射4小时测ΔA值。紫外－可见分光光度法应用实例：差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量3.精密称取胆红素2mg于50ml棕色量瓶中，加入适量冷(10℃以下)的酸性氯仿(150ml氯仿中含0.05ml浓盐酸)，于冰水浴中超声振荡20分钟，稀释至刻度，制成储备液。准确吸取0，4、0．8、1，2、1.6、2.0ml储备液于10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，测其光照前后在453nm处的吸收度。回归方程为ΔA=0.0804C+0.00570(r=0.9995)。注释：除光照反应外，其余操作均需避光紫外－可见分光光度法应用实例：差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量4.分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液，在453nm处测得各自光照前后的A值，计算ΔA。实验表明三种成药ΔA值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在以上光照条件下不干扰胆红素的测定。紫外－可见分光光度法应用实例：差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红