单克隆抗体的制备和应用

单克隆抗体的制备和应用基础部免疫教研室金伯泉20世纪有关抗体的生理学和医学诺贝尔奖项获奖年代学者获奖成就1901E.A.Behring发现抗毒素，开创免疫血清疗法1908P.Ehrlich抗体生成的侧链学说E.Metchnikoff细胞吞噬作用1913C.Richet发现过敏现象1960F.M.Burnet抗体生成的克隆选择学说P.B.Medawar1972G.M.Edelman抗体的化学结构R.M.Porter1977R.S.Yalow创立放射免疫测定法1984G.KöhlerB细胞杂交瘤和单克隆抗体C.MilsteinN.Jerne免疫网络学说1987Tonegawa抗体多样性的遗传学基础NielsK.JerneGeorgesJ.F.KöhlerCésarMilsteinB淋巴细胞杂交瘤技术是如何创立的应用SRBC为免疫原免疫小鼠为模型,观察抗体产生细胞的体细胞突变(Somaticmutation)Hybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495导致了在生命科学领域中的一场革命克隆（Clone）又名无性繁殖系，指由一个祖先细胞经分化、增殖所产生的遗传性状完全相同的细胞群多克隆抗体（Polyclonalantibody,pAb）用包含多种抗原决定基的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体的总和，称为多克隆抗体单克隆抗体（MonoclonalAntibody,mAb）由一个杂交瘤细胞克隆所产生的，针对单一抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体单克隆抗体的优点单特异性和均一性无限供应用混合的抗原制备出识别一个抗原决定簇的抗体杂交细胞（hybridcell）在外界某些条件干预下（如PEG、电穿孔），当两个细胞紧密地接触的时候,其细胞膜可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体/基因的单个细胞，称为杂交细胞杂交瘤细胞（Hybridomas）若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，简称杂交瘤。其既具有肿瘤细胞无限增殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性B淋巴细胞杂交瘤骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合所产生的杂交瘤细胞B淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理B细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞抗原制备免疫动物骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的筛选及克隆化单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的主要步骤一、抗原细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射1~2×107个细胞。颗粒性抗原：可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。可溶性抗原：B淋巴细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，有利于细胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。多次免疫可通过抗体亲和力成熟机制，使B细胞分泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高的应用价值。二、免疫动物免疫目的：采用与骨髓瘤供体同一品系的动物免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。动物的选择：动物对抗原刺激易产生免疫应答反应8~12周龄雌性小鼠（最常用BALB/c）第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后检测血清效价加强免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠腹腔注射细胞融合3天后免疫程序：脾（spleen）抗原脾（spleen）所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同三、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备骨髓瘤细胞系的选择要点：自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链对氨基碟呤敏感与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌Ig杂交瘤细胞饲养细胞的作用：小鼠腹腔巨噬细胞小鼠脾细胞饲养细胞（feedercell）：增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对细胞密度的要求吞噬清除死亡的细胞分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长饲养细胞的种类和制备方法：四、细胞融合融合前的准备工作准备HAT、HT培养液、融合剂PEG准备饲养细胞准备骨髓瘤细胞准备免疫脾细胞拉颈处死小鼠无菌操作取出脾脏清洗、研磨收集细胞离心洗涤细胞计数脾细胞的准备收集细胞离心洗涤活细胞计数调整细胞浓度骨髓瘤细胞的准备细胞融合骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合1:10或1:5加入促融剂PEGPEG在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞五、杂交瘤细胞的选择性培养HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成有主要途径和补偿途径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成的主要途径，需通过补偿途径合成DNA，这时就需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。用于杂交瘤融合的骨髓细胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT和TK，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合的杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从免疫B细胞得到HGPRT和TK的基因产物，因此，能够克服氨基碟呤的阻断作用，通过次黄嘌呤的补偿途径合成DNA，而在HAT选择培养液中生长繁殖。融合后3~4天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。融合后第7~9天取培养上清，检测特异性抗体。细胞生长情况六、杂交瘤细胞的筛选及克隆化杂交瘤分泌单克隆抗体的检测方法免疫酶技术——间接ELISA包被抗原、培养上清、酶标抗体、加底物显色阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清阳性对照：免疫鼠血清免疫荧光技术间接免疫荧光（或酶）测定法：靶细胞铺片、固定细胞、加待测样品、加荧光标记抗体（或加酶标抗体和显色底物）、镜检活细胞免疫荧光技术：流式细胞术分析杂交瘤细胞的克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。克隆化—即把培养孔中的细胞从单个细胞进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗体达到均一性。有限稀释法软琼脂培养法以适当浓度杂交瘤细胞加入软琼脂培养基中，形成由一个细胞增殖而成的细胞集落。杂交瘤细胞的克隆化筛选：免疫球蛋白类别及亚类的鉴定七、单克隆抗体的鉴定小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，其分泌的特异性McAb的本质仍是小鼠的不同类型及其亚类的免疫球蛋白（Ig），其中以IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3等亚类）最常見，其次为IgM。抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体分子结合表位部位和抗原决定簇之间的互补程度决定。特异性是否与其他抗原有交叉反应敏感性对腹水和培养上清进行效价测定亲和力测定八、单克隆抗体的制备动物体内诱生法取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1~2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体约1~2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。将杂交瘤细胞置于培养瓶（或灌）中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体。收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体，不含无关Ig，但成本髙。体外培养法我国单克隆抗体的发展历史和前景早期研究阶段全军单克隆抗体研究协作组（单克隆抗体通迅）应用和市场化HLDAHCDM功能基因组研究中的重要地位国家重大科技项目（973、863等）主要研究内容之一单克隆抗体的应用基础理论研究（生命科学）发病机理的研究疾病的预防（紧急预防）疾病的诊断（传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷病）疾病的治疗（治疗性抗体）——一项重要的生物技术和一类生物高科技产品单克隆抗体在生命科学和医学中的广泛应用从医学到生命科学的各个领域从基础研究到临床应用从诊断到预防和治疗•MHC•细胞表面分子•血型•肿瘤相关抗原和分子•抗Ig的同种异型•激素、细胞因子和血浆成分•纯化干扰素•病原生物传染性疾病HIV:急性感染期和晚期:核心抗原p24升高;检测抗HIV抗体初筛;免疫印迹进一步确认;CD4+T细胞200/l病情严重HAV、HBV、HCV:抗体HFRS:免疫荧光，ELISA（特异性IgM）肿瘤多种肿瘤的标志物直肠结肠癌:CEA前列腺癌:PSA原发性肝癌:AFP淋巴瘤和白血病:CD分子自身免疫性和过敏性疾病自身抗体（抗核抗体、类风湿因子）放射免疫测定法（RIA）检测特异性IgE甲状腺素、胰岛素、生长激素其他血型检测：凝集反应（直接和间接）早孕:人绒毛膜促性腺激素（hCG）男性不育:抗精子抗体单克隆抗体在临床诊断中应用FabmurineantibodychimericmouseantibodyFvdAbengineeredbispecificAbScFvHumanizedF(ab)2HumanizedantibodyScFv-toxinintrabodyNumberoftherapeuticmAbsenteringclinicalstudyperyearTherapeuticcategoriesformAbsinclinicalstudy通用名批准时间类型识别抗原适应症Muromonab-CD31986mouseCD3急性肾移植移植排斥Daclizumab;Basiliximab1997;1998humanized/chimericIL-2R(CD25)急性肾移植移植排斥Rituximab;Tositumomab;Ibritumomab1997;2002;2003mouse/chimericCD20B细胞-非何杰金氏淋巴瘤、类风湿性关节炎Alemtuzumab2001humanizedCD52慢性B淋巴细胞性白血病Gemtuzumabozogamicin2000chimericCD33急性粒细胞性白血病Edrecolomab*1995mouseEP-CAM结、直肠癌Trastuzumab1998humanizedHER-2HER-2过表达的转移性乳腺癌Cetuximab2004humanizedEGFR转移性结肠癌、头颈部癌症Bevacizumab2004;2006humanizedVEGF转移性结肠癌,年龄相关性黄斑病变Infliximab1998;2002chimeric/humanTNF-α节段性回肠炎、类风湿关节炎,银屑病性关节炎;强直性脊柱炎Efalizumab2003humanizedCD11a银屑病Natalizumab2004humanα4整合素多发性硬化症Omalizumab2003humanizedIgE过敏性哮喘Abciximab1994chimericGPⅡb/Ⅲa冠心病血小板Palivizumab1998humanizedRSV呼吸道合胞病毒感染CharacteriztionofmAbsagainstEpCAMbyIHCandIF肿瘤器官移植排斥自身免疫性疾病其他CD20,CD52,CD33,HER-2EGFR,VEGF,EP-CAMCD3,IL-2R（CD25）TNF-α,CD11a,α4整合素,CD20GPⅡb/Ⅲa,IgE,RSVgpFMechanismsofmAb-mediatedkillingCD20表达于B淋巴细胞，其抗体可促进细胞对化疗的敏感性，诱导细胞凋亡、ADCC、CDCCD33表达于90%以上的急性髓样白血病(AML)细胞，但不表达于骨髓CD34+造血干细胞，其抗体可诱导双链DNA断裂和细胞死亡CD5