circRNA引物设计

汉恒生物circRNA引物设计circRNA引物设计circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。目前关于circRNA的研究非常热门，然而很多人苦于对调取circRNA全长及验证circRNA的成环性表达知之甚少，因而感觉对circRNA的研究无从下手。本文通过图文并茂的方式，向大家分享circRNA调取引物及验证成环引物的设计方法，希望能帮助各位顺利开展circRNA的研究课题。一、circRNA全长调取（用于构建过表达载体）1、首先根据circRNA的ID号找到全长序列，以hsa_circ_0036388为例，打开circBase网站：，输入ID后搜索，得到如下界面：汉恒生物circRNA引物设计2、点击fasta，并将弹出网页中的circsequence选项更改为“spliced”，再点击“search”，即可下载circRNA的全长序列的fasta格式。3、fasta文件可用记事本直接打开，得到如下结果：4、针对上述序列，即可设计circRNA的全长序列调取引物，设计方法不常规基因引物设计完全一致。注：如在circRNA全长序列外，还想同时获得上下游的延伸序列，可在步骤2参数设置时填写需要延伸的碱基数，如下图所示：汉恒生物circRNA引物设计二、circRNA验证引物设计circRNA的验证不普通mRNA相比，还需增加一条——确定是否成环。因此，circRNA验证引物需设计在junctionsite两侧，确保PCR扩增片段包含junctionsite（如下图所示，上图显示环状序列，下图显示线性化序列）。1、将circRNA序列的5’端300bp序列用黄色高亮标记，3’端300bp序列用蓝色高亮标记：汉恒生物circRNA引物设计2、将circRNA全长序列的3’端300bp序列移至5’端300bp序列上游，得到如下序列：3、针对2中的600bp序列设计对应的PCR引物，设计方法同常规引物设计即可，但是两条引物需要分别位于蓝色区域和黄色区域，以确保扩增产物中包含circRNA的junctionsite。注1：如circRNA全长小于600bp，则可将300bp相应缩短，只要保证最终扩增产物中含有junctionsite，确定其成环状态即可。注2：circRNA验证表达，提取RNA后丌可使用oligodT来进行反转，必须使用随机引物。