第五章：-折光指数增量(dndc)与浓度检测器(dRI)-2019

©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved11SpecificRefractiveIndexIncrement&ConcentrationDetectorsLightScatteringUniversityWyattTechnologyCorporationCHINA©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved22•绝对折射率增量（SpecificRefractiveIndexIncrement,dn/dc）•测定dn/dc:方法•单机测定dn/dc(batchmode)•联机测定dn/dc(on-linemode)•测定第三方示差折光检测器常数•dn/dc测定主要内容©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved33•dn/dc表示高分子溶液折射率随其浓度的变化的物理量•高分子dn/dc的测定，需将其浓度外推至零。•测定dn/dc要求：•待测样品；•试验溶剂条件下；•与LS检测波长相同；目的：准确测定分子量。（即使使用UV作为浓度型检测器）绝对折射率增量，dn/dc©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved44不同溶剂条件下，高分子dn/dc估算名称折射率(n)PS[mL/g]的dn/dc（633nm）Polystyrene(PS)1.59XXXToluene1.4970.11THF1.4070.185Trichlorobenzene1.5720.02(measured:0.04)折射率增量可使用以下方法估算*：dn/dcp(npolymer–nsolvent)or:(dn/dc)solventB(dn/dc)solventA–p(nsolventB–nsolventA)p=偏比容,通常假定为1*from:“SizeExclusionChromatography”,byS.Mori,H.G.Barth,SpringerVerlag,1999?©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved55dn/dc与波长关系•一般情况，水相体系中，同一样品在波长分别为690nm和490nm条件下测定dn/dc值差别≤5%。•若已知若干不同波长下样品dn/dc值，则以dn/dcvs.1/λ2作图，可以估算任意波长下的dn/dc。0.10.120.140.160.180.20.220.241.50E-062.00E-062.50E-063.00E-063.50E-064.00E-064.50E-065.00E-065.50E-061/lambda^2dn/dcPSinToluenePSinTHFNaClinH2OLinear(PSinToluene)Linear(PSinTHF)Linear(NaClinH2O)488nm633nm690nm©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved66dn/dcvs.molecularweight0.050.060.070.080.090.10.110.120.130.140.1510100100010000100000Mw(Da)dn/dc(mL/g)PEGdn/dc与摩尔质量关系范例:不同分子量PEG在水中的dn/dc值0.142当Mw＞10,000Da时，dn/dc近似为常数©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved77•使用流动相配制至少6个浓度梯度的待测样品溶液。•每一浓度的进样体积需保证RI信号出现平台。•“第一针”与“最后一针”需注入流动相，以获得基线（baseline）测定dn/dc(off-line)solventFlatplateausofknownconcentrations©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved88测定dn/dc(off-line)•OptilabrEX测定每一浓度的折射率增量Δn；ASTRA软件计算最佳拟合，并以Δnvs.concentration作图。•直线斜率即为：d(Δn)/dcordn/dccxcdn)d(n©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved99•若已知以下参数，ASTRA可在联机模式下计算dn/dc值:a)已知样品浓度；b)已知进样体积；c)已知流速；d)100%样品被洗脱出来；注意:若使用第三方浓度型检测器，必须知道其校正常数（calibrationconstant），例如dn/dV利用SEC/RI联机估算dn/dc©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1010第三方示差检测器校正校正常数RICC是折射率增量(Δn)与RI第三方示差型检测器检测电压变化值(ΔV)的比值，该比值为一常数:ASTRA根据第三方示差检测器检测电压信号、RICC值以及dn/dc值计算未知样品浓度：dcdnRIVcccsampleVdndRICC©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1111•以超纯水配制不同浓度梯度的NaCl溶液。•依次将超纯水，不同浓度NaCl溶液，超纯水，注入RI池子，获取平台信号（V）。•推荐的NaCl溶液浓度梯度范围：0.1~1mg/mL第三方示差检测器校正程序©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1212ASTRA计算第三方示差检测器校正常数•计算每一浓度的折射率增量（n）:n=cx(dn/dc)•以nvs.V作图，其斜率即为校正常数（calibrationconstant）(ASTRA软件中对应:AUXcalibrationconstant)VdndslopeconstantAUX©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1313•dn/dc用途:•光散射法测定分子量；•RI测定浓度；•第三方是擦检测器校正常数；•dn/dc与以下因素有关:•高分子成分；•摩尔质量；•溶剂；•激光波长；•以下途径获取dn/dc：•文献；•直接由RI检测器测定(onlineoroffline)•dn/dc值应在与LS相同波长、相同样品、相同溶剂条件下测定。结论©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1414附录UseofaUVDetectorasaConcentrationDetector©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1515•UV检测器可以作为浓度型检测器用于SEC-MALS系统中：•已知高分子消光系数（extinctioncoefficient）（需UV检测波长下测定）o蛋白质消光系数可根据氨基酸种类估算o若已知dn/dc，ASTRA可计算消光系数•需已知UV检测器响应因子值（responsefactor）•需已知UV检测池长度值（cellpathlength）使用UV为浓度检测器©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1616•UV检测器直接测定的量为吸光度A:式中•：消光系数，mL/(gxcm)•c：浓度，g/mL•L：检测池长度，cm•ASTRA软件根据响应因子和检测池长度，将UV电压值转换为吸光度值。•若消光系数已知，则根据吸光度直接可计算样品的浓度。UV检测器如何计算浓度？©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1717•范例：使用SEC-MALS与紫外检测器联用测定牛血清蛋白时(BSA)，以下参数需要输入：odn/dc=0.185mL/g(波长690nm)og/mL=660AU/(cmxg/mL)（波长280nm下测定）oUVcellpathlength=0.60cmoUVresponsefactor=1AU/V•即使使用UV检测器作为浓度检测器，但样品dn/dc必须已知。因为光散射方程中必须使用该值。SEC-MALS与紫外检测器联用测定BSA©WyattTechnologyCorporation–AllRightsReserved1818•若MALS系统中同时使用RI和UV检测器时，待测样品的dn/dc可在线估算：•若已知样品消光系数，ASTRA软件根据UV信号可以计算其真实洗脱质量（calculatedmass）；•以洗脱质量替代进样质量，ASTRA软件根据RI信号可以计算dn/dc值；•利用UV检测器，无需假设样品100%被洗脱出来。•若样品dn/dc已知，则根据RI与UV信号，可以估算消光系数。•若dn/dc和消光系数已知，则系统RI-UV-MALS可表征共聚物、改性蛋白中不同组分的含量和摩尔质量。同时使用RI和UV检测器