PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理

.PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理授课人：刘翔宇.目录一．核酸基本知识二．PCR的发展史三．PCR技术简介四．实时荧光PCR技术五．实时荧光PCR的临床应用六．新冠病毒核酸检测原理.一、核酸基本知识核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧啶U。核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。.核酸的基本结构.遗传信息传递的中心法则.DNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配对的原则进行半保留复制。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。.二、PCR的发展史1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学,分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。.1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶的发现使PCR广泛的被应用。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、PCR污染少、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。.第一代：手动/机械手式水浴基因扩增用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。.第二代：自动化控制型PCR使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。且无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。.第三代PCR：实时荧光定量PCR为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的表达水平进行定量分析，1992年诞生了所谓“第三代PCR的荧光定量实时PCR。所谓real-timeQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。.第四代PCR：数字PCR由于定量PCR的分析最终结果依赖于Ct值，在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字PCR应运而生。数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。.三、PCR技术简介高温可以使双链DNA解链成为单链，这一过程称为变性。变性后的DNA通过降温可以重新接合为双链，这一过程称为复性。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。.利用温度的升降来控制DNA的变性和复性。设计引物作为启动序列，加入DNA聚合酶、dNTP（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完成特定基因的体外复制。周而复始的升降温度进行扩增，每一循环可以使靶序列增加一倍。.PCR扩增步骤DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA的含量既增加一倍。.PCR扩增示意图.30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824.常用的ＰＣＲ技术定性ＰＣＲ电泳检测、放射自显影特异性差、易污染、只能定性ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ特异性较好，极易污染、定量不准确终点法荧光ＰＣＲ特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好实时荧光ＰＣＲ特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好.四、实时荧光PCR技术实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。.荧光PCR的原理.实时荧光PCR常用的三个概念扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，仪器可自动计算，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。.实时荧光PCR扩增曲线示意图.手工调整荧光阈值示意图.Ct值的意义Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增Ct值与浓度不同浓度的模板达到荧光域值时的Ct值不同.PCR扩增的理论模式Yn=X*(1+E)n，0≤E≤1，E为扩增效率,X为原始模板数,Y为PCR产物的分子数量,n为周期数。模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。.标准曲线的建立梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。.实时荧光定量PCR技术的特点灵敏度高特异性强快速简便应用范围广.五、实时荧光PCR的临床应用感染性疾病的诊断母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断法医学鉴定早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察、指导新药验证.感染性疾病的诊断1.病原体含量与病情之间的关系2.病原体含量与用药之间的关系3.药物及疗法的研究与开发4.新的病原体分子诊断标准5.新的愈后指标6.传染病发病的监控、预测与预防.六、新冠病毒核酸检测原理对新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab及编码核衣壳蛋白N或E基因的特异性保守序列为靶区域，进行了双靶标基因的设计，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量RT-PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒RNA的检测。.ThankYou!