体内药物分析

体内药物分析在临床合理用药中新药评价和新药开发一、概述利用分析手段，了解药物在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学的参数、药物的生物转化、代谢方式和途径等信息，为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对待研究的药物作出估计与评价。2、体内药物分析的意义1、体内药物分析的性质3、体内药物分析的任务监测药物浓度药代动力学研究分析方法学的研究(1)干扰杂质多(2)被测组分浓度低（10-6-10-9g/ml）(3)样品量少——要求分析方法灵敏及具有专属性(4)要求较快提供结果——工作量大、数据和结果分析较为复杂4、体内药物分析的特点——分离、富集●脏器组织：心脏、肾、肝、脾、脑组织、皮肤●体液：血液、唾液、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁等●毛发●排泄物：尿液、粪便等血液(血浆、血清)—体现药物浓度和治疗作用之间的关系。尿样：尿药排泄量，药物肾清除率，药物代谢和生物利用度—用于药物滥用监测及微量元素测定用药史的估计—临床用药和药物非法滥用的区别、毒性药物检测。—研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡。二、生物样品的种类根据不同的分析目的与要求；正确反映药物浓度与效应之间的关系；便于获取，易于处理。1、样本的采集●血样制备纤维蛋白原凝血因子纤维蛋白，血液凝固血浆血浆plasmaplasma——血液加入含抗凝剂的试管中，离心，取上清血清血清serumserum——血液不加抗凝剂，自然放置后，离心，取上清全血wholeblood——抗凝剂，血浆与血细胞混合三、生物样品的采集和贮存冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)中长期保存冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定2、样本的贮存血样－离心，冷冻保存；有时加入稳定剂尿液－立即测定，否则应冷藏或加防腐剂常用稳定剂：酶抑制剂（NaF、三氯醋酸）、抗氧剂常用防腐剂：甲苯，氯仿，醋酸等。问题1、实际样品的复杂性使用掩蔽剂分离separation控制实验条件问题2、分析方法灵敏度的局限性富集enrichment选择灵敏度高的方法干扰的消除满足对灵敏度的要求分离与富集的原因杂质的存在怎么办呢？待测物含量为ppm(10-6)或ppb(10-9)级，而选择的测定方法的灵敏度仅为10－5－10－4级。四、样品的预处理(分离、富集）1、原因及目的提高被测物的浓度（富集）除去杂质分离纯化预处理的的目的改善分析环境提高分析效能药物释放测定总浓度衍生化，提高测定灵敏度对分离的要求对分离的要求((分离完全的含义分离完全的含义))待测组分的损失小至忽略不计(回收率越高越好)干扰成分消除且不引入新的干扰物2、方法简单毒性小%100%´原始含量分离后测量值）回收率（回收率测定方法：加标法测量待测组分含量不同对回收率的要求也不相同待测组分含量不同对回收率的要求也不相同对回收率的要求对回收率的要求质量分数大于1％0．01％一1％低于0．01％回收率99．9％99％90％一95％常量组分常量组分微量组分微量组分痕量组分痕量组分待测组分待测组分3、生物样品的预处理技术有机破坏蛋白质的去除方法缀合物的水解方法游离药物分析的样品前处理方法(1)有机破坏法样品的无机化处理：将样品中的有机物分解，仅剩下无机成分。干法破坏干法破坏————高温炉或低温等离子体灰化湿法破坏——硝酸或硝酸-高氯酸氧瓶燃烧（oxygenflaskcombustion）——硫、卤素、磷、硼、金属成分——微量元素的测定、金属有机药物含量测定适用于血、尿、组织等生物样品的破坏。对含氮杂环药物的破坏不够完全。湿法破坏电热板加热消化硝酸-高氯酸法破坏后得到呈高价态的无机金属离子微波消解马弗炉灰化法、低温等离子体灰化法适合人发样品的破坏干法破坏原理：有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，生成CO2、H2O和待测元素的氧化物或无氧酸，被吸收于适当的吸收液中，然后采用适宜的方法进行分析。C-Cl+O2HCl↑NaCl点燃NaOH特点：仪器简单、简便、快速、破坏完全氧瓶燃烧法A.燃烧瓶B.铂丝网固体样品无灰滤纸液体样品纸袋含氟HF茜素氟蓝比色法水氯HCl银量法NaOH溶液溴Br2+HBr银量法H2O－NaOH－SO2碘I2+HI+HIO3+HIO银量法H2O－NaOH－SO2间接碘量法H2O－NaOH硫SO3BaCl2滴定H2O2－H2O硒SeO2二氨基萘滴定法硝酸溶液吸收液的选择吸收液测定方法产物药物类型(2)蛋白质的去除方法•加入与水相混溶的有机溶剂脱水：•加入中性盐盐析：•加入强酸生成不溶性盐：•加入重金属盐类沉淀剂：•热凝固法：乙腈，甲醇，丙酮，THF饱和硫酸铵，硫酸钠，磷酸钠，NaCl，枸橼酸盐10%三氯醋酸，6%高氯酸CuSO4-Na2WO4,ZnSO4-NaOH将热变性蛋白质除去(3)缀合物（conjugate)的水解缀合物：药物或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物。内源性物质：葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽、醋酸等。酸水解法：HCl酶水解法：葡萄糖醛酸苷酶硫酸酯酶溶剂解法：硫酸酯萃取过程中被分解。(4)游离药物分析的样品前处理方法•半透膜只允许小分子药物通过，而不允许蛋白质等大分子物质通过，故可分离游离型药物。•缺点：所需血样量较多，耗时长。平衡透析法：游离型血药浓度才与药理作用强度密切相关。一般，药物与血浆蛋白的结合为可逆反应，其结合率相对稳定,故血药总浓度近似于游离血药浓度。但病理因素会改变蛋白结合率。超滤法：以多孔性半透膜---超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术。超滤膜是一种具有不对称结构的多孔膜，是超滤技术的关键。超离心法凝胶过滤法●萃取分离法液－液萃取固相(微)萃取超临界流体萃取离子对萃取法膜萃取法●微透析法柱切换技术湍流色谱法4、提取分离及相关技术有机相水相（a）萃取原理利用混合物中待测溶质在不同溶剂里的溶解度的不同利用混合物中待测溶质在不同溶剂里的溶解度的不同而分离。液－液萃取液－液萃取((有机溶剂萃取有机溶剂萃取))分配定律：分配定律：用有机溶剂从水相中萃取溶质用有机溶剂从水相中萃取溶质AA时，如时，如果溶质果溶质AA在两相中存在的型体相同，平衡时在两相中存在的型体相同，平衡时在有机相中的浓度在有机相中的浓度[A][A]有有和在水相中的浓度和在水相中的浓度[A][A]水水之比在给定温度下，是一常数。之比在给定温度下，是一常数。（b）分配系数和分配比常用萃取剂氯仿、乙酸乙酯●●选择分配比选择分配比(D)(D)大的有机溶剂大的有机溶剂((“相似相溶”)。●●萃取剂和原溶剂互不相溶和不发生化萃取剂和原溶剂互不相溶和不发生化学反应。学反应。(c)萃取剂选择告诉你，应该这样选择萃取剂：仪器选择：通常用仪器选择：通常用6060一一125ml125ml的梨形的梨形分液漏斗进行萃取。分液漏斗进行萃取。（d）萃取方法注意：漏液检查、放气这样振摇萃取过程：样品溶液与有机萃取剂混合(1︰1或2︰1)，振摇。将水相与有机相分开：萃取后应让溶液静置数分钟，待其分层，然后将萃取后应让溶液静置数分钟，待其分层，然后将两相分开。两相分开。萃取原则：少量多次。除去有机剂，获得产物：挥发，蒸馏，氮气吹干等。优点：简便、富集、提取率高缺点：●费时，工作量较大；●萃取溶剂常是易挥发、易燃和有毒的物质。(f)液-液萃取优缺点(e)连续萃取分配系数较小物质的萃取，采用连续萃取器。索氏萃取器原理：根据试样中不同组份在固相填料上的作用力强弱不同,使被测组份与其他组份分离。固相萃取固相萃取((层析法层析法))固相萃取固相萃取的装置主要分柱型和盘型两种①固相柱选择：②固相柱处理:③上样④柱清洗：⑤柱干燥：⑥洗脱待测物：依据样品体积、药物的量选择柱尺寸依据药物理化性质和样品溶剂强度（洗脱强度）选择固定相如反相C18等亲脂性键合硅胶SPE柱：甲醇湿润，活化，除杂；水或缓冲液冲洗除去剩余的甲醇。用合适的弱溶剂洗涤洗去杂质收集洗脱液，待分析样品溶液通过SPE柱，弃去滤过的废液•离线SPE操作：后续分析需要避免水分干扰时采用•柱切换HPLC：两个泵，预柱,分析柱•影响液-固萃取的主要因素上样流速上样流速快：按触不充分，样品流失回收率低上样量：过载样品突破性试验：突破体积一系列体积的已知浓度样品液上样，洗脱后，求回收率；当回收率下降时为过载。固相萃取法特点固相萃取法特点优点优点①①引入杂质少引入杂质少②②完全避免乳化的形成完全避免乳化的形成③③在优化条件下有较高萃取率、重现性较好在优化条件下有较高萃取率、重现性较好④④使用的溶剂大多可与水混溶，易于自动化使用的溶剂大多可与水混溶，易于自动化缺点①价格昂贵②技术要求高③批-批之间有差异SPME是在SPE基础上发展起来的一种新型萃取分离技术。由加拿大Waterloo大学Pawliszyn于1990年提出（ArthurCl,PawliszynJ.Anal.Chem.,1990,62:2145）。美国Supelco公司于1993年推出了商品化的固相微萃取装置。固相微萃取（SolidPhaseMicroextraction，SPME）该法既不使用溶剂，也不需要复杂的仪器设备。固相微萃取SPME萃取三种操作方式：★直接法：将SPME纤维头直接插入水相或暴露于气体样品中进行萃取的方法。★顶空法：将SPME萃取头置于分析样品的上部空间进行萃取。★膜保护法：通过一个选择性的高分子材料膜将试样与萃取头分离，以实现间接萃取。膜的作用：保护萃取头使其不被基质污染，同时提高萃取选择性。SPME萃取条件的选择：萃取头、萃取时间、搅拌、加温•适用于极性很大、离子性特强的药物•酸性药物：产生阴离子如-COO-,-SO3H-离子对试剂：烷基季铵盐•碱性药物：产生阳离子如-NH+离子对试剂：烷基或芳基磺酸盐离子对萃取ion-pairextraction萃取常数分配常数:•影响提取效率的因素：反离子的浓度，有机溶剂种类超临界流体萃取SupercriticalFluidExtraction,SFE超临界流体（SupercriticalFluid，SF）是处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上，介于气体和液体之间的流体。SFE-GCSFE-HPLCSFE-FTIRSFE-NMRSFE-MSSFE-SFC（supercriticalfluidchromatography)具有类似气体的较强穿透力和类似于液体的较大密度和溶解度，具有良好的溶剂特性，可作为溶剂进行萃取、分离单体。膜萃取membraneextraction,ME利用膜在两相间的选择性屏障作用进行分离富集的方法。有孔膜萃取,无孔膜萃取技术膜类型原理驱动力主要联用仪透析有孔分子排阻浓度差异LC电透析有孔分子排阻和选择离子传输电位差异CE过滤有孔分子排阻压力差异LC膜萃取无孔分配系数浓度差异LC,GC,CE基于膜萃取的样品制备技术其它新型萃取技术搅拌棒萃取固体分散萃取单滴微萃取浊点萃取凝聚层萃取微透析技术（Microdialysis,MD）利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术。可以用来研究生物体在活动时体液组成的一些变化。——膜分离技术活体微透析技术原理示意图◆时间分辨性◆空间分辨性◆与色谱技术联用在线分析MD-HPLC,MD-CE优点不足：◆回收率低,通常在15%左右；且测定回收率的方法有待改善；◆探针的植入会造成局部轻微的损伤；◆要求探头必须准确插在同一取样部位；◆很难进行以秒为单位的动态观察。MD的特点色谱分析法•GC分析衍生化：提高药物的挥发性增加药物的热稳定性生成非对映异构体提高药物的挥发性增加药物的热稳定性生成非对映异构体光谱分析法：紫外可见分光光度法荧光分光光度法5、化学衍生化GC分析常用衍生方法（1）硅烷化：-OH-COOH-SH-NH2=NH-O-Si(CH3)3-COO-Si(CH3)3-S-Si(CH3)3-NH-Si(CH3)3-NSi(CH3)Si(CH3)=N-Si(CH3)3TMS33常见的三甲硅烷化试剂(CH3)3SiNHSi(CH3)3(CH3)3SiClCH3