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课题五DNA的粗提取与鉴定一、基础知识（一）提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2、生物大分子主要指蛋白质、酶和核酸3、提取DNA的基本思路利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分（1）DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反讨论：①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？4.DNA等大分子的理化性质在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为2mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为0．14mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离（2）DNA在酒精溶液中的溶解性（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。5、DNA的鉴定①DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂②甲基绿（蓝绿色）原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料）2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜2、植物细胞讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质讨论：方案一中为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离（四）DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,进一步纯化DNA为什么要加等体积的预冷酒精？2、DNA的鉴定鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。练习1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。2.实验中NaCl的物质的量浓度为2mol／L和0.14mol／L对DNA有何影响?1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：B答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成()A.砖红色B.橘黄色C.紫色D.蓝色4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液?答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。答：D