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生物技术药物制剂中国药科大学药剂学教研室本章学习要求：•掌握生物技术的概念和生物技术药物的特点和理化性质。•掌握蛋白质类药物的处方与工艺。•熟悉掌握蛋白质类药物新型给药系统和评价方法。教学内容•第一节概述•第二节蛋白质类药物的结构特点与理化性质•第三节蛋白质类药物的评价方法•第四节蛋白质类药物制剂的处方与工艺•第五节蛋白质类药物新的给药系统•第六节蛋白质类药物制剂的评价第一节概述•一、生物技术的基本概念•生物技术或称生物工程（biotechnology),是应用生物体（包括微生物，动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。•现代生物技术主要包括基因工程，细胞工程与酶工程。此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程。•基因工程又称遗传工程，它是经体外非同源DNA重组使基因转移到宿主细胞中，使后者获得纯品，为生产低耗，廉价产品，开辟了一条新途径。细胞工程包括基因，染色体，基因组，细胞质，细胞融合工程，细胞融合技术亦称细胞杂交技术（hybridizationtechniques)是生产单克隆抗体一类试剂或药物的主药手段。酶工程是将水溶性的固相酶，使在酶促反应中以固相状态作为底物，产生纯酶。•二、生物技术药物产品•生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约40多种，正在研究的数百种之多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。•1、定义•系指由重组产品、天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物药物的总称。•2、现代生物药物的分类•(1)基因重组多肽、蛋白质类治疗剂(即重组DNA技术)；•(2)基因药物(基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酸)；•(3)天然生物药物(动物、植物、微生物和海洋生物药物)；•(4)合成和部分合成生物药物。•3、生物技术药物的特点•多数受胃酸及消化酶的降解破坏•其生物半衰期亦较短，需频繁注射给药•即使皮下或肌肉注射，其生物利用度也较低•长期注射易造成患者心理和生理的痛苦•另外，多数多肽和蛋白质类药物不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障。•三、生物技术药物及其制剂的发展前景•1、发展概况•自1982年第一个重组药物：人工胰岛素上市以来，第二代生物技术药物正在取代第一代多肽、蛋白质类替代治疗剂。•第一代重组药物是一级结构与天然产物完全一致的药物；•第二代生物技术药物是应用蛋白质工程技术制造的自然界不存在的新的重组药物。•美国一直稳居生物技术药物研发榜首，已上市116个药物，治疗数百种疾病，2000年产值超过200亿美元；已有723种生物技术药物正在通过FDA审批。•德国已超过日本，到2001年底已有68种药物上市，正在临床试验的有100多个。•日本多数药物是与美国合作的产物，已上市的有50个药物。•我国已批准上市的品种有21种，主要通过跟踪研究与创仿相结合的方法，目前已步入自主创新阶段，并以“新型生物技术药物和疫苗”作为发展重点。•目前以生物技术，微电子，新材料，新能源，海洋工程和空间技术等为主要内容的新技术革命浪潮正以万钧之势迅猛发展。•在新技术革命中，生物技术又是各国优先发展的领域。传统的经典制药工业由于基因工程，细胞融合，酶工程，结构修饰等现代生物技术的渗入，使医药产品的发展进入了一个新的时期。尽管这类产品目前还不太多，但它代表了医药产品发展的方向。•随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给药物制剂带来新的挑战，由于生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性能很不稳定，极易变质，因此如何将这类药物制成稳定，安全，有效的制剂，就是摆在我们面前的一大难题。•运用制剂手段将注射用药制成口服或其他途径给药，亦即研究新的给药系统，也是一项十分艰巨的任务。由于这类药物及其制剂疗效独特应用日益广泛，因而具有进一步研究的价值和广阔的发展前景。•一、蛋白质的结构特点•(一)蛋白质的组成和一般结构•蛋白质是由许多氨基酸按一定排列顺序通过肽键相连而成的多肽链。•蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成，肽链数目，末端组成，氨基酸排列顺序和二硫键的位置等。组成蛋白质的氨基酸有20多种。连接氨基酸之间的键称为酰胺键，又称肽键，是蛋白质中氨基酸之间连接最基本的共价键。第二节蛋白质类药物的结构特点与理化性质•蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构：•一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。•二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级结构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。•(二)蛋白质的高级结构•蛋白质的高级结构包括二级，三级与四级结构：•二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有α螺旋结构与β折叠形式。•三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合的方式，系一条多肽链中所有原子的空间排部。•四级结构是指具有三级结构的蛋白质的各亚基聚合而成的大分子蛋白质。•胰岛素的四级结构可以由两个以上的分子量为6000或12000的小亚基聚合而成。•所谓亚基就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这些多肽链彼此以非共价链相连，每一条多肽链都有自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚单位（亚基）。•蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。•蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象（conformation)时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力（hydrophobicforce)、离子键、范德华力、二硫键与配位键。除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构县是弱作用力。•蛋白质分子中二级结构α螺旋、β折叠的形成依靠氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。•疏水作用力也称疏水键，系两个疏水基为了避开水相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级结构起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。•范德华力对稳定和维持三级，四级结构十分重要。•离子键对于维持蛋白质四级结构是不櫷缺少的。不少蛋白质含有金属离子，而金属离子是通过配位键与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非氨基酸通过配位组成。•二、蛋白质的理化性质•(一)蛋白质的一般理化性质•1、旋光性•蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。•蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。•2、紫外吸收•大部分蛋白质均含有带苯丙氨酸，酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。•3、蛋白质两性本质与电学性质•蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的側链上还有很多解离基团，这些解离基团在一定pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质会成为阳离子，阴离子或二性离子。•(二)蛋白质不稳定的原因•1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解，氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换。有时几种反应同时进行。•蛋白质的化学降解过程和各种可能的机制的相对发生率取决于蛋白质的性质，温度，pH，离子强度，氧气浓度和溶质的存在。很明显蛋白质溶液中的氢离子浓度对水解反应有很大的影响，pH对其它一些化学过程也起着重要作用。•蛋白质在其等电点（IP）时一般最稳定，溶解也最少。在蛋白质等电点相应的pH所有离子的净电荷为零，因而减少了电荷排斥和蛋白质伸展的趋势。•(1)蛋白质水解•蛋白质可被酸，碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐步变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸。•水解分完全水解与不完全水解。•完全水解是在5.7mol/L盐酸中于110°C高温20小时可完全变成氨基酸。•不完全水解是在酶或稀氨酸较温和的条件下进行，水解产物有肽段与氨基酸。•初级蛋白质的水解是肽键的水解与脱酰氨基作用。•脱酰氨基作用是谷氨酰胺与天冬酰胺側键酰胺的水解。•脱酰胺作用引入新的负电荷可影响三级结构与稳定性。••(2)蛋白质的氧化•蛋白质中具有芳香側链的氨基酸可以在一些氧化剂作用下氧化。•常用氧化剂有分子氧、过氧化氢、过甲酸、氧自由基等。•影响氧化的因素有温度、pH、缓冲介质、催化剂的种类和氧的强度。•疏基的氧化在碱性pH特别在金属离子的存在下容易发生。•蛋白质的立体排列可以影响氧化反应及其结果，氧化的疏基暴露在蛋白质表面，接着形成分子间的二硫键导致蛋白质聚集。•(3)外消旋作用(racemization)•某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或L-型化合物转变为D-型和L-型各50%的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。•当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用。•影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH、离子强度和金属离子螯合作用。•蛋白质中氨基酸的消旋作用一般能使氨基酸成为非代谢的形式(nonmetabolizableforms)。•(4)二硫键及其交换•二硫键（-S-S-）又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化学键。它是由两个半胱氨酸側链上的-SH疏基脱氢相连而成。•二硫键把同一肽链或不同肽链（肽链间）的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。•蛋白质分子中二硫键的数目愈多，则结构稳定性和抗拒外界因素的能力也愈强。•蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性。•二硫键交换（bisulfidebondexchange)可由硫醇类催化。•2、由非共价键引起的不稳定性•引起蛋白质不可逆失活作用的三种主要类型即聚集（aggregation)，宏观沉淀，和表面吸附与蛋白质变性，这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起。•非共价的静电力，氢键，疏水的相互作用以及蛋白质的水化，可以因温度于pH而发生改变。•蛋白质的不可逆失活，一般以自然状态开始可逆的伸展，随着温度的增加，溶液中的蛋白质分子在熔融温度(Tm)从天然的转变为伸展状态。•Tm定义为50%分子伸展的温度。•溶液的pH对蛋白质净电荷的影响取决于蛋白质的PI(等电点)。因此溶液pH可以影响静电的相互作用。•(1)蛋白质的聚集与沉淀•蛋白质聚集(凝集，aggregation)是蛋白质分子结合的微观过程。•蛋白质沉淀(precipitation)指可见蛋白质颗粒的生成。•不可逆的聚集往往是由于蛋白质伸展所致。•蛋白质伸展将内部的疏水区暴露于溶剂分子中(通常是水)，亲水性溶剂分子围绕疏水蛋白质区这样一种结构在热力学上是不稳定的，这就驱使暴露的疏水区分子间相互反应而导致聚集。•蛋白质溶液振摇可以导致聚集与沉淀，这是由于空气氧化，界面变性，吸附于容器或机械应力所致。•(2)蛋白质的吸附•蛋白质和多肽吸附于容器、滤器或输液系统材料的表面，当蛋白质溶液浓度较低时，由于吸附药物损失相对就较高。•由于疏水的和静电的引起的表面吸附，使蛋白质聚集将依赖于蛋白质的构象状况，溶液的pH和离子强度以及表面的性质。•蛋白质与表面之间的相互作用随表面疏水性和蛋白质疏水性的增加而增加。•(3)蛋白质的变性•蛋白质在受到一些物理因素或化学试剂影响会导致蛋白质性质发生变化，即破坏蛋白质分子三维结构有关氢键及其他弱键(二级结构以上的高级结构的破坏)，导致蛋白质生物活性的丧失(抗原性改变，生物功能丧失)同时还伴随一些物化常数的变化。如发生溶解度的降低、旋光值改变、光吸收系数的增大、粘度改变、聚集，沉淀等。但蛋白质的一级结构即肽键没有被破坏,这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。•蛋白质的变性也可以说是从肽链的折叠（refolding)状态变到伸展（unfolding)状态。•天然蛋白质是指在体内条件下，它具有呈现全部生物功能所需要的精确的构象。•天然蛋白质分子是由多肽链所组成，分子的规则性紧密结构是由分子中的次级键维持，它很容易被物理