生物样品的制备

第二章生物样品的制备生物样品处理的主要问题：1.组成复杂，易变2.样品量有限3.分离纯化的步骤繁多4.浓度变化范围宽5.生物分子易失活6.难评估2.1生物分析化学分析对象的复杂性生物样品预处理的基本原则：步骤少、时间短，获得尽可能多的目标组分通常包括以下考虑因素：1.确定要处理的生物分子的目的和要求2.掌握目标产物的物理、化学以及生物学性质3.生物材料的破碎和预处理4.分离纯化方案的选择和探索5.评价生物分子纯度的检验方法6.产物的浓缩、干燥和保存物理、化学及生物学性质的考虑：1、水溶液和各种有机溶剂中的溶解性2、不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性3、对温度、含水量和冻干时的稳定性4、分子的大小、带电的情况、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的扩散系数等5、对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性等6、对其他生物分子的特殊亲和力7、组织及细胞内的定位分布等真核细胞的亚细胞器：（a）动物细胞；（b）植物细胞2.2激光捕获显微切割技术（laser-capturemicrodissection，LCM）在显微镜下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、分离，获取均匀性很好的目标细胞。A：大鼠子宫上皮H&E-染色的冰冻切片样品B：人空肠Cy2-Ab抗Cytokeratin上皮细胞冰冻切片样品C：石腊包埋H&E-染色的前列腺样品D：人血液中Giemsa-染色的白细胞样品E：大鼠小神经元细胞Nissl-染色的样品F：小鼠HistoGene-染色的肾小球冰冻切片样品2.3细胞的破碎细胞破碎的目的：使被分离的分子充分地释放到溶剂中，与细胞中其它化合物和生物大分子分离，并由固相转入液相，并尽可能保持原有的生物活性。将目标分子从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中的过程。细胞破碎方法剧烈程度应用对象机械法研磨法剧烈固体组织细胞、微生物细胞组织捣碎法（匀浆法）剧烈固体组织细胞、微生物细胞物理法反复冻融法温和细菌细胞、组织培养细胞超声波处理法剧烈悬浮细胞压榨法剧烈微生物细胞、含有细胞壁的细胞冷热交替法温和细菌细胞或病毒化学与生物化学法自溶法温和组织及各种细胞溶胀法温和血细胞、组织培养细胞酶解法温和植物细胞、细菌细胞、真菌细胞细胞破碎方法一、水溶液提取：稀盐和缓冲溶液对蛋白质等生物大分子的稳定性好、溶解度大。考虑的影响因素如下：1、盐浓度（即离子强度）：在低离子强度的溶液中绝大多数蛋白质和酶都有较大的溶解度，此为“盐溶”现象；中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。2.4生物大分子的提取2、pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值密切相关，一般提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内（pH=6～8），通常选择在偏离等电点的pH条件。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取。3、温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0～5℃的低温操作。4、防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：可采用加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性。例如在提取DNA时加入EDTA络合Mg2+使DNAase失活。5、搅拌与氧化：采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的氧化变性失活。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸可以防止肽链上的巯基的氧化。二、有机溶剂提取一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中。采用稀的有机溶液提取常常可以避免水解酶的破坏。例：胰岛素的溶剂提取胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但组织样品中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0，进行提取，因为：①乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++③pH2.5～3.0下糜蛋白酶活性低以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，还可同时除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验。常用的分离纯化方法和技术有：离心法、沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、透析法、色谱法、等电聚焦制备电泳法等。2.5生物大分子的分离和纯化一、离心分离1、利用离心作用将目标组分依据密度不同进行分离的技术2、相对离心力，RCF（重力加速度的倍数）离心半径10cm，转速40000r/min时的RCF可达200000g！3、沉降系数，Swedberg单位，单位离心力作用下的沉降速度4、等密度离心法，用梯度溶液形成密度梯度，粒子或分子从离心管顶部进入与其等密度的位置时不受力；甚至可分离RNA和DNA5、用以收集细胞，细胞器，生物大分子等6、分离条件温和，但是温度需要控制二、等电点沉淀法等电点沉淀法是利用蛋白具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，因此单独使用此法效果不理想，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其它沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目标蛋白。三、生物样品的膜分离透析•半透膜（纤维素)-大分子被截留，盐和小分子扩散通过•截留分子量指标•透析袋内为保留液，外为渗出液或者透析液•用于样品除盐、少量有机溶剂、生物小分子等；保留液体积经常增加（可达50%）超滤•加压膜分离技术，一定压力下小分子溶剂和溶质透过一定孔径的膜（乙酸纤维或硝酸纤维），而大分子不能通过•生物大分子的脱盐，脱水和浓缩(10-50%)四、高丰度蛋白的去除问题1.使结合在白蛋白、免疫球蛋白上的低丰度蛋白质解离出来并富集2.使2DE图象更加清晰3.减少2DE的斑点数，提高对2-DE斑点进行质谱分析的准确度4.提高2-DE上低丰度蛋白质的载容量和大分子量的蛋白质分子的分辨率，提高低丰度蛋白质被识别的几率例：从血清/血浆中寻求生物标志物的关键是去除样品中占主导地位的高丰度蛋白质。血清/血浆样品中高丰度蛋白质：白蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G等六种蛋白质，占血清/血浆中蛋白质质量数的85%。目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和柱色谱法和化学试剂除去法。全局蛋白组分析样品的基本要求：1.溶解包括疏水蛋白在内的各种蛋白质；2.防止在等电聚焦过程中蛋白质聚积和析出；3.避免制备过程中可能的蛋白质化学修饰和降解；4.去除或降解产生干扰的其它物质；5.去除高丰度或不相关的蛋白质，提高低含量蛋白的浓度，使其达到分析检测的要求。蛋白样品处理中经常使用的添加剂：1、变性剂（尿素，打开氢键、增溶）2、去垢剂（CHAPS，SDS等，消除疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性）3、两性电解质（减少蛋白聚合，维持其溶解性）4、还原剂（DDT，二硫苏糖醇，用于打开二硫键）5、烷基化-SH，保护其不被再氧化6、蛋白酶抑制剂（防止蛋白质降解等）五、蛋白质的分步提取法（1998年Moloy等提出）第一步，亲水性蛋白。用40mmol/LTris去离子水溶液反复冻融处理，加入适量的DNaseI和RNaseA；第二步，亲水性，中性和较疏水性的蛋白。提取液中含有表面活性剂CHAPS，还原剂DDT，裂解剂Urea等；第三步，疏水性蛋白。裂解液中添加能够促进疏水蛋白质溶解的表面活性剂SB3-10，还原剂DDT，裂解剂硫脲（thiourea）等。关于蛋白质顺序提取过程的一些建议：1、为防止降解，加入1mM苯甲基磺酰氟（PMSF，一种酶抑制剂）；2、为防止降解，建议分步提取法中的第一和第二步在4C离心，离心速度为12000g；3、为防止析出，蛋白提取过程中建议第三步在15C离心，离心速度为12000g；4、为提高双向电泳（2DE）图谱质量，建议加入核酸酶：样品中终浓度10-100ug/mlDNase-5-25ug/mlRnase；5、第二步提取后样品中未溶解蛋白质已很少，减少第三步提取液用量为标准方法的一半；6、第三步提取后样品中仍有少量未溶解蛋白质，建议用SDS溶解后通过PAGE胶分离，胶内酶解，LC-MS鉴定。常用蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂有效抑制的酶缺点PMSF（很常用，使用浓度为1mM）不可逆抑制剂，抑制：1.丝氨酸水解酶2.胱氨酸水解酶在含水溶液中很快失活毒性大多肽水解蛋白抑制剂（如亮肽素leupeptin,抑肽素pepstatin,抑肽酶aprotinin和苯丁抑制剂bestain）亮肽素抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑肽素抑制天冬氨酸蛋白酶抑肽酶抑制许多丝氨酸蛋白酶苯丁抑制剂抑制氨基酸多肽酶价格昂贵为小分子多肽，在双向电泳结果中出现抑肽素pepstatin在pH为9时不能发挥其抑制作用1mMEDTA,1mMEGTA抑制金属蛋白酶除去影响双向电泳的污染物：污染物除杂技术样品制备过程中带来的盐、残留缓冲液和其它带电小分子1、透析2、旋转透析3、凝胶过滤4、沉淀/重悬法内源性带电小分子（核苷、代谢物、磷脂等）TCA/丙酮沉淀法核酸(DNA,RNA)1、DNase/RNase2、超速离心3、超声多糖，脂类TCA，丙酮沉淀法不溶物离心六、核酸提取例-细菌培养液的DNA提取1、培养液离心使细菌沉淀与试管底部；将沉淀分散在TE溶液（Tris-HClEDTA，pH8.0）；2、用SDS和蛋白酶K水浴37℃温育1小时进行细胞裂解；3、加入NaCl和CTAB水浴65℃温育20分钟去多糖等；4、加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液抽提；离心分离（核酸溶于上层的水相）；取水相加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，离心分离取上清液；5、加入RNaseA37℃温育30分钟分解去除RNA；6、温育后加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，离心取上清液中加入无水乙醇，混合静置后得白色絮状沉淀；7、取絮状沉淀并在75%乙醇中清洗后风干，溶于TE溶液中4℃保存或者-80℃长期保存；8、UV吸收法测定纯度及浓度，凝胶电泳分离；RNA样品提取流程：•液氮研磨分散•细胞裂解•水溶液抽提，离心分离•酒精沉淀或者介质吸附•沉淀的离心洗涤•溶解或者洗脱•纯度检测对试剂及操作环境要求非常严格！！！RNA的处理过程中的降解问题：裂解液质量和用量外源NRase的污染组织裂解不充分富含内源性酶的样品（脾脏，胸腺等）难以避免RNA的降解在液氮条件下进行组织研碎2.6固相萃取（SolidPhaseExtraction，SPE）利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附从而与样品基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。SPE可用于气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（IR）、质谱（MS）、核磁共振（NMR）、紫外可见光谱（UV/VIS）和原子吸收（AAS）等各种分析方法的样品预处理。与液－液萃取相比的优点：不需要大量互不相溶的溶剂，简化样品处理过程，减少时间（1/2)和费用(1/5)。缺点：目标化合物的回收率和精密度要低于液－液萃取。