液相柱色谱技术

第三章液相柱色谱技术色谱法（chromatography）又称色谱分析、色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。按流动相性质液相色谱法气相色谱法超临界流体色谱法按分离原理吸附色谱法离子交换色谱法亲和色谱法按固定相状态柱色谱法平面色谱法分配色谱法排阻色谱法目录3.1液相柱色谱分析的基本原理3.2描述色谱过程的速率理论3.3HPLC系统3.4液相色谱分离模式3.5整体色谱柱3.1液相柱色谱分析的基本原理3.1.1色谱分离过程实现色谱操作的基本条件是必须具有相对运动的两相，其中一相固定不动，即固定相‘另一相是携带试样向前流动的流动体，即流动相。固定相装填在色谱柱(column)中。混合试样中的组分随流动相经过色谱柱时,与固定相发生相互作用,由于结构和性质的差异,各组分与固定相作用的类型、强度不同,使其在固定相上的滞留时间或被流动相携带移动的速度不同,产生差速迁移,因而被分离。3.1.2色谱图和峰参数3.2描述色谱过程的速率理论色谱分离包括两个基本的过程:①差速迁移。每一种组分通过色谱柱时,都有在流动相和固定相间多次“分配”的过程,由于各种组分与两相的相互作用不同,在柱内的迁移速度不同,这是实现分离的基础。②谱带展宽。流动相携带组分通过色谱柱时,由于线速度快,组分在固定相与流动相间不可能达到真正的“分配”平衡;同时,还存在组分在色谱柱中的纵向扩散,这些因素导致被分离组分的谱带逐渐变宽而使柱效下降。因此,色谱分离的好坏是由差速迁移和谱带展宽决定的。只有最大限度地实现差速迁移和抑制谱带展宽才能得到理想的色谱分离结果。3.3HPLC系统HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处理和计算机控制系统等组成，其中，输液泵、进样器、色谱柱是三大关键部件。3.4液相色谱分离模式吸附色谱法化学键合相色谱法反相离子对色谱法离子交换色谱法凝胶过滤色谱法变性高效液相色谱法亲和色谱法3.4.1吸附色谱法吸附色谱法是指利用吸附性的不同而进行的色谱分离和分析的方法，它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用来达到提取和分离的目的的。1吸附色谱法原理液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。2吸附色谱法的固定相极性固定相非极性固定相新型表面多孔硅胶粒子双重孔径硅胶粒子庞大多孔硅胶粒子高聚物微球石墨化碳黑聚合物包被固定相3流动相3.4.2化学键合相色谱法化学键合相色谱法是使用化学键合固定相(bondedphase)的色谱法。化学键合固定相是指通过化学反应的方式将功能基团键合于基质上而形成的固定相。化学键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的位置,适用于分离几乎所有类型的化合物,是应用最为广泛的色谱法。其主要优点是:均一性和稳定性好,柱效高,重现性好,键合相和流动相选择范围宽等。1正相键合相色谱法固定相极性大于流动相极性的键合相色谱法称为正相键合相色谱法。正相键合相色谱法采用极性键合固定相,是由氨基、氯基、芳硝基、二醇基,醚基等通过烷基链键合在硅胶表面面形成的。流动相与吸附色谱中的流动相相似,也是非极性溶剂或弱极性溶剂,如庚烷、己烷及异辛烷等加人适量极性调整剂(如醇类)。正相键合相色谱法的分离原理主要是根据化合物在固定相及流动相中的分配系数不同进行分离。强极性组分的容量因子k大,后洗脱出柱。流动相溶剂的极性越强,洗脱能力也越强,使组分k减小,t减小;反之,k增大,t增大。它适于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。2反相键合相色谱法固定相极性小于流动相极性的键合相色谱法称为反相键合相色谱法。反相键合相色谱法采用非极性键合固定相,是由一些直链烷烃基团,如正辛基,正十八烷基等键合在硅胶表面形成的。反相键合相色谱法的分析对象几乎遍及所有类型的有机化合物,在HPLC中,约70%~80%的工作是由反相键合相色谱法完成的。反相键合相色谱法主要通过疏溶剂作用滞留溶质,是存在于极性溶剂中的一种非极性相互作用。当极性溶剂中存在非极性(或含有非极性基团)溶质时,非极性溶质分子或溶质分子中的非极性部分之间会产生排斥力,这种排斥力就称为疏溶剂作用。疏溶剂作用的存在使溶质分子从极性溶剂中被“挤”出去,在固定相上产生不同程度的保留。因此,在反相色谱中,疏水性越强的化合物越容易从流动相中被“挤”出去,在色谱柱中滞留的时间也越长。所以,在反相键合相色谱法中,不同的化合物是根据它们的疏水特性得到分离的。反相键合相色谱法使用的流动相是甲醇、乙腈、水等极性比固定相强的溶剂乙醇、四氢呋喃、异丙醇及二氧六环等也常被使用。水在流动相中所占比例的伸缩性很大,为0~100%。流动相溶剂的极性越强,使组分k增大,t增大,洗脱能力越明;反之,k减小,t减小。可以通过改变流动相的溶剂组成和pH影响溶质分子与流动相的相互作用,改变其滞留行为。3化学键合固定相1)键合固定相的性质和特点键合相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和烷烃。目前使用的反相键合相主要为硅氧烷(Si-O-S-C)型键合相,以氯硅烷与硅胶表面的硅醇基进行硅烷化反应而制得。键合到硅胶表面的直链饱和烷烃的量以含碳量表示,对于商品键合相,含碳量在2%~50%,一般为10%。基团的键合量也可用表面覆盖率表示,即参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。含碳量或表面覆盖率越大,对溶质的保留值也越大。此外,由于键合基团的空间位阻效应,使硅醇基不能全部参加键合反应,残余硅醇基对键合固定相特别是非极性键合固定相的性能影响很大,它减弱了键合定相表面的疏水性,对极性溶质产生次级化学吸附,使保留机制复杂化。为减少残余硅醇基,一般在键合反应后,需要使用三甲基氯硅烷进行封尾(end-capping)是理,以降低其吸附性能。使用键合固定相时应注意:①流动相中水相的pH应维持在2~8,pH8会引起基质硅胶的溶解,pH1.0时键合的硅烷会被水解而从柱中洗脱下来②不同厂家、不同批号的同一类型键合固定相可能会表现出不同的色谱特性。2)键合固定相的种类（1）非极性键合固定相这类固定相通常用于反相色谱,表面的键合基团为多种形式的非极性烃基、烃基链等,溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合,而产生保留行为。十八烷基硅烷键合相(octadecylsilane,ODS或C18)是应用最为广泛的非极性键合固定相。其硅胶表面有一层疏溶剂特性较强的C18烷基“分子毛”,与极性流动相接触时,其周围形成“疏溶剂腔”,极性流力相中的非极性分子或分子中的非极性部分因疏溶剂作用进入“疏溶剂腔C烷基产生缔合,使溶质在固定相表面产生保留。非极性键合固定相根据表面键合基团的不同,主要分为以下种类:①键合不同长度单一烷基链(如C4、C8、C12、C18、C22、C30)的固定相。键合基团的烷基链长,硅醇基对溶质的保留行为、选择性和载样量都有影响。直链饱和烷烃的硫水特性随着烷基链长度的增加而增加,使溶质容量因子k增大,保留时间延长,分离选择性改善,载样量提高,而短链烷基键合固定相分析速度较快,对于极性化合物可以得到较好的色谱峰。②键合苯基的固定相,其性能与短链烷基键合固定相类似。③键合长、短两种烷基链(如Ca和C3)的固定相,又称为水平聚合(horizontalpolymerization)键合固定相,其硅胶表面的硅醇基全部参加反应,使残留的硅醇基得到有效的保护④键合iC3和iC4侧链的C烷基链固定相,又称为立体保护键合固定相,它通过立体效应阻碍硅醇基与溶质的相互作用。⑤键合中间镶嵌极性官能团(氨基、酰胺基、季铵基、氨基甲酸酯基)烷基链的固定相,又称为静电屏蔽(electrostaticshield)键合固定相,它通过烷基链中下部镶嵌的极性官能团屏蔽硅醇基与分析物的相互作用。(2)弱极性键合固定相二醇基键合相具有弱极性,可用于3种分离模式,正相及反相分离模式用于于分离有机酸及其共聚物,还可用作分离蛋白质的凝胶过滤色谱固定相醚基键合相具有斥电子基团,具有弱极性,可用于3种分离模式,正相及反相分离模式适于分离酚类及芳硝基化合物,也可用作分离蛋白质的凝胶过滤色谱固定相。(3)极性键合固定相胺基键合相兼有质子接受体和给予体的双重性能,具有强极性,可用于3种分离模式:正相色谱用于分离极性化合物,如芳胺取代物、脂类、甾族化合物、氯代农药等;反相色谱用于分离单糖、双糖和多糖;还可在酸性水溶液中作为弱阴离子交换剂,用于分离酚、羧酸、核苷酸。氰基键合相为质子接受体,具有中等极性,可用于两种分离模式:正相色谱用于分离极性化合物;反相色谱可提供与C18、C8、苯基柱不同的选择性。芳硝基键合相具有电荷转移功能,具有弱极性,可用于正相及反相分离模式,对芳香族化合物及多环芳烃的分离有良好的选择性。4流动相在化学键合相色谱法中,溶剂的洗脱能力(即溶剂强度)与它的极性相关。在正相键合相色谱法中,由于固定相是极性的,所以溶剂的极性越强,洗脱能力越强在反相键合相色谱法中,由于固定相是非极性的,所以溶剂的极性越强,洗脱能力越弱,而弱极性溶剂具有强的洗脱能力。水是极性最强的溶剂,也是反相键合相色谱中洗脱能力最弱的溶剂。描述溶剂极性的方法有多种,常用的是溶剂极性参数(polarityparameter,P’)法。P’值越大,溶剂的极性越强,在正相键合相色谱中的洗脱能力越强。可通过改变流动相来改善色谱分离的选择性,主要有以下方法：1)调节流动相的极性在HPLC分析中,为使溶质获得良好的分离,通常希望溶质的容量因子k值保持在1~10。若溶质的k值大于10或小于1时,可通过调节流动相的极性,来获取适宜的k值。正相键合相色谱中,固定相的极性大于流动相的极性,因此,若k值大于10或小于1,可通过增加或减小流动相极性,调整溶质k值至1-10;而反相键合相色谱调节方法则反之。2)向流动相中加入改性剂(1)离子排制色谱法(ISC）反相键合相色谱中,常加入少量弱酸、弱碱或缓冲溶液来调节流动相的pH抑制有机弱酸、弱碱的解离,增加它与固定相的疏水缔合作用,使k值位于1-10。ISC适用于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱,对于弱酸,降低流动相的pH，,k值增大,tR增大;对于弱碱,提高流动相的pH,k值增大,tR增大。(2)离子强度调节法用反相键合相色谱分析易解离的碱性有机物时,随流动相pH的增加,键合相表面的硅醇基与碱阴离子的亲和力增加,从而引起峰形拖尾并干扰分离。可向流动相中加人0.1%~1%的乙酸盐或硫酸盐、硼酸盐,利用盐效应减弱砖醇基的干扰作用。向含水流动相中加入无机盐后,会使其表面张力增大。对非离子型溶质,会引起k值增加;对离子型溶质,随盐效应的增强,会引起k值减小。3.4.3反相离子对色谱法1、RPIC的分离原理2、RPIC容量因子k的影响因素1）离子对试剂的种类和浓度2）流动相3.4.4离子交换色谱法1离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱是蛋白纯化技术中常用的一种纯化方法，其原理是指被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而被分离出来。2离子交换剂的类型疏水性亲水性阳离子交换树脂阴离子交换树脂螯合离子交换树脂纤维素离子交换树脂交联葡萄糖离子交换树脂琼脂糖离子交换树脂3离子交换色谱的流动相离子交换色谱的流动相为