透明质酸酶抑制实验

Elson-Morgan改良法一、实验原理透明质酸酶是Ⅰ型过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，研究报道各种肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，一些抗敏药物有强抑制透明质酸酶活性，因此抑制透明质酸酶活性作为研究抗过敏作用的指标。二、试剂和仪器1、透明质酸酶：浓度500U/ml，现配现用，不能过夜，用醋酸缓冲液做溶剂；2、透明质酸钠：0.5mg/ml，一次配制，多次使用，用醋酸缓冲液做溶剂；3、Buffer：溶液A（0.2mol/L醋酸11.55ml冰醋酸溶于1L蒸馏水中）4.8ml溶液B（0.2mol/L醋酸钠16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于1L蒸馏水中）45.2ml，混合稀释至100ml，配制成PH=5.6的醋酸缓冲液；4、乙酰丙酮溶液：50ml1.0mol/L碳酸钠溶液和3.5ml乙酰丙酮溶液混合均匀（临用现配）5、P-DAB显色剂：0.8g对二甲氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇混合均匀。6、氯化钙溶液CaCl2：2.5mol/L7、氢氧化钠溶液NaOH：5mol/L样品参考浓度1.2mg/ml三、试验步骤试剂A管（ml）B管（ml）C管（ml）D管（ml）样品0.50.5蒸馏水0.50.5透明质酸酶0.50.5醋酸缓冲液0.50.537℃，保温20minCaCl2溶液0.10.10.10.137℃，保温20min透明质酸钠0.50.5醋酸缓冲液0.50.537℃，保温40min；放置室温10min蒸馏水0.50.50.50.5NaOH溶液0.10.10.10.1乙酰丙酮溶液0.50.50.50.5沸水浴15min；冰浴10min；放置室温10minP-DAB1111各管充分振荡后加无水乙醇至8ml放置室温30min530nm处测吸光值四、计算透明质酸酶抑制率（%）=[(C-D)-(A-B)]/(C-D)×100%试中：A—（透明质酸酶+样品+透明质酸钠）试样溶液的OD值B—（醋酸缓冲液+样品+醋酸缓冲液）试样空白的OD值C—（透明质酸酶+去离子水+透明质酸钠）对照溶液的OD值D—（醋酸缓冲液+去离子水+醋酸缓冲液）对照空白的OD值