Seahorse海马代谢仪使用说明

汇报人：学号：背景生物能量学（Bioenergetic）探讨的是生物将氧份转为能量并借此推动生命的过程。不同的细胞依据其生理特性及健康状况，能量供需系统亦有所不同。能量代谢老化神经退化性疾病糖尿病肥胖心血管疾病癌症各类药物毒理机制简介美国海马生物科学利用细胞外流量（ExtracellularFlux，XF）检测专利技术，发明了业界第一款海马细胞能量代谢实时测定仪/生物能量代谢测定仪（SeahorseXFExtracellularFluxAnalyzers），是进行细胞代谢分析、氧呼吸测定、药物代谢分析、线粒体有氧代谢和糖酵解等功能的最佳分析工具。特点：通过特殊的细胞培养微孔板设计，在测量时临时形成的约2ul微环境中，利用无创的专利光学传感器同步地实时探测溶解氧（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）变化，从而快速了解细胞内两大能量转换途径（线粒体的有氧代谢和糖酵解）的能量代谢状态。仪器外观HydroBoosterSensorCartridgeCartridgeLid耗材自动药物注射端口启用实时功能分析水化探针1.在UtilityPlate每孔中加入1ml校准液(SeahorseXF校准液用于溶解和校准XF小柱，并包含FluxPak)实验前一天2.将HydroBooster放在UtilityPlate上，SensorCartridge放在最上面3.放入无CO2的培养箱，37℃过夜（使校准液能浸没在sensors中；保证培养箱湿度，防止干燥）培养细胞1.100ul培养液收集细胞，按最佳细胞密度重悬细胞（10,000-80,000个细胞/孔）。2.每孔接种100μL细胞悬液，背景校正孔（A1,B4,C3,D6）不接种细胞。将细胞板室温静置在超净台上1h。3.将细胞板放置在细胞培养箱中让细胞贴壁（快1h；慢5-6h），在显微镜下观察细胞是否贴壁。4.细胞贴壁后，每孔加入150μL生长培养液，总体积为250μL。加液时，沿壁轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。5.将细胞放置在细胞培养箱中过夜培养。在显微镜下观察细胞的生长状态。预热仪器打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃，过夜预热。准备XF检测液一个培养板手动加液需100ml，仪器加液需200ml1.使用NaOH调节pH值至7.35±0.052.检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。3.37℃放置备用。NOsodiumbicarbonateLowphenolred(3mg/L)实验当天处理细胞1.将细胞培养板从CO2培养箱中取出，并记录时间。2.在显微镜下观察细胞（无污染，细胞均匀状态好，贴壁未脱落，背景矫正孔无细胞。）3.用XF细胞线粒体压力测试检测液洗细胞：a.吸去生长培养液至每孔剩余50μL。b.用1mLXF检测液洗细胞两次。c.每孔加入检测液至终体积为500μL/孔。4.在显微镜下观察细胞，确认细胞在换液过程中没有脱落。5.将细胞板置于37°C无CO2培养箱中1h。配制XF细胞线粒体压力测试盒中药物母液检测液体积终浓度Oligomycin630μL100μMFCCP720μL100μMRotenone/AntimycinA540μL50μM将药物稀释为10×浓度，用于加到加药孔中3.取300μL50μMrotenone/antimycinA母液至2700μL检测液中。2.按以下表格，用检测液将FCCP稀释为不同的浓度1.按左边表格，用3mL检测液将oligomycin稀释为所需浓度（或使用大多数细胞都适用的1μM）。加药从无CO2培养箱中取出已水化的测试板。按以下说明，将药物分别加到每个加药孔里。加药孔A：细胞孔内oligomycin终浓度为1μM。每个A孔加入56μL10×药物。加药孔B：测定浓度的FCCP。将62μL10×的不同浓度药物加入到B孔里。加药孔C：细胞孔内Rot/AA终浓度为0.5μM。每个C孔加入69μL10×药物。选择模板（提前预热）Injectionstrategies---add---strategy1----A----add----mitostresstest1BC同样Pretreatment----add-----不用做修改AssayMedia-----MitoStresstestmedium填写相关信息：Name,CellType,Seedingdensity（CellType2，3，4同样），之后点击“GenerateGroup”查看“PlateMap”设置颜色默认的Mix-Wait-Measure时间为3min-2min-3min。通常在加药前测量3次基础值；每次加药后再进行3次测量。“Injection”多少种药点多少次ReviewRun-----PlateInformation-----WellVolume-----Plateby-----StartRun，放入测试板。当软件出现校准完成提示时，将Utility板换为细胞培养板。点击Continue。仪器完成OCR值测定，数据分析。寡霉素：ATP合酶抑制剂；FCCP：解偶联剂；抗霉素A/鱼藤酮：呼吸链抑制剂；HowdoIknowwhetherthecelldensityisgood?•BasalOCRrange:20-160pmol/min•MaximumrecommendedOCR:400pmol/min•ECAR:5-100mpH/min优势特点：采用超敏感的生物传感器和非接触式设计，真正实现检测细胞零损伤；实时检测细胞有氧呼吸、糖酵解的能量代谢情况，即时反应细胞生理状态；同步检测细胞的耗氧量和产酸率（pH值变化），数据结果更加全面；实现同步检测96/24个细胞样品，通量高，速度快；自动化检测流程、自动化控制添加多达四种药物，操作方便高效。