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分子生物学研究：核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。1953年，Watson和Crick提出脱氧核糖核苷酸的双螺旋膜型。染色体包括：DNA和蛋白质两大部分。基因组：由生物体内所有的染色体组成的。真核细胞染色体的组成包括：蛋白质：组蛋白（染色体结构蛋白，组成核小体）、非组蛋白（RNA聚合酶、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白），真核生物基因组DNA，染色质和核小体。DNA包装步骤：（核小体，螺线管，超螺线管，染色体）1)核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一阶段。核小体的组成：组蛋白+200bpDNA。核小体组蛋白：H2A、H2B、H3、H4各两分子生成的八聚体，并伴有H1在核小体在外边，直径10nm。2)将200bp的DNA分子（2nm）缠绕在核小体外，从68nm压缩到10nm中，压缩率1/73)六个核小体形成一个螺线管，压缩率1/6，直径30nm4)螺线管形成超螺线管，压缩率1/40，直径4000nm5)超螺线管形成染色单体，压缩率1/5DNA的结构：（1）DNA的一级结构：四种核苷酸的连接排列顺序。（2）DNA的二级结构：两条多核苷酸链反相平行盘绕所成的双螺旋结构。（3）DNA的高级结构：多数为双链DNA，少数为单链；形成超螺旋，构成质粒分类：右手螺旋（A-DNA构象、B-DNA构象）、左手螺旋（Z-DNA构象）B-DNA构象特点：1）A-T丰富的DNA片段常呈B-DNA构型；2）脱氧核苷酸在外侧，碱基在内侧；3）链间形成的有螺旋状凹槽构成：大沟、小沟（沟用来接收Pr的结合）；4)相邻碱基对平面间距0.34nm，结构重复周期3.4nm，双螺旋直径2.0nm；5)磷酸二脂键链接核苷酸；6)脱氧核糖环平面基本与纵轴大致平行A-DNA构象：DNA模板链与转录所得RNA链间形成的双链，双链RNA之间形成的构象也是A-DNA构象.Z-DNA构象特点：1）12个碱基一圈，比A构型紧；2）只有一个螺旋沟，难于蛋白质结合；3）重复的结构式二核苷酸；4）碱基不再中央，外圈的碱基难被化学物质结合识别意义：用于调控基因转录，Z构型变为B构型，可以使得近端区域活化转录；使得远端基因转录停止。DNA的复制：(1)步骤：1)解链：DNA链改变构象，从复制叉开始解链，此为DNA复制的起点2)拓扑：防止超螺旋3)单链结合蛋白（SSB）结合单链DNA：4)引物结合：RNA引物提供3`-OH末端5)DNA聚合酶：去掉结合蛋白，切除RNA引物6)滑动夹：推动DNA聚合酶前进7)DNA连接(2)原料：1)拓扑异构酶；2)解旋酶；3)单链结合蛋白（SSB）；4)引物合成酶；5)DNA聚合酶3（复制链）；、6)DNA聚合酶1（切引物）；7)连接酶；8)dNTP；9)RNA引物（含3`-OH末端）DNA半保留复制：每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链来自新和成的。DNA半不连续复制：DNA复制时，双链解开，SSB和DNA聚合酶3共同作用合成前导链随复制叉前进（5`端→3`端）；另一条后随链的复制由RNA引物开始一个片段一个片段的复制（5`端→3`端），形成众多冈崎片段，之后切除引物，用DNA连接酶连接断开的单链。DNA修复：（分类，定义，AP位点）（1）错配修复：保存母链，修正子链。识别新合成链中的错配并校正DNA子链。（2）切除修复：1）碱基切除修复：切除AP位点(存在于DNA链上的去嘌呤或去嘧啶位点)两端的磷酸二酯键，换上相应的核苷酸。2）核苷酸切除修复：切除无法形成氢键的核苷酸。DNA的转座：或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子：又称易位子，存在于染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。分类：插入序列（IS）、复合型转座子玉米中的控制因子：Ac-Ds系统（激活-解离系统）：Ac能够自主转座，形成不稳定基因突变，使Ds因子活化、转座。Ds属于非自主因子，解离因子，当Ac存在时导致附近结构基因失活和表达水平的变化。转座作用的机制：转座可被分为复制型和非复制型两类。基因表达：转录（拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤）和翻译（以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码翻译成氨基酸、合成多肽的过程，是基因表达的最终目的）。DPPH依赖于RNA聚合酶基因转录：(1)启动子：基因转录起始所必需的一段DNA序列，确保转录精确起始，是基因表达调控的上游顺式作用元件之一。是指确保转录精确而有效地起始的DNA序列。(2)转录单元：是一段从启动子开始至终止子结束DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA连。(3)增强子，或强化子：一种能强化转录起始的序列。(4)原核生物包括：-10区与-35区，其最佳距离大约是16-19bp。真核生物mRNA特点：(1)mRNA的5`端存在“帽子”结构（甲基化鸟嘌呤）；(2)绝大多数真核生物mRNA具有多聚A尾巴(1)“帽子”结构作用：1有助于翻译的开始：与核糖体小亚基相结合；2保护mRNA不被降解，半衰期长；3成熟产物运输过程中的必需物质；4促进转录(2)多聚腺苷酸尾巴作用：1穿过核膜所必须的部分；2提高mRNA的稳定性；3与翻译有关原核生物转录终止的类型：不依赖于ρ因子的终止和依赖于ρ因子的终止类型RNA的编辑：是某些RNA，特别是一种mRNA前体的加工方式，如插入、删除、取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。核酶：一类具有催化功能的RNA分子，通过催化RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性剪切底物RNA分子，从而断裂基因的表达。其根据不同的核酸具有的催化功能分为：剪切型核酶、剪接型核酶。遗传密码的性质：（1）密码的连续性；（2）密码的简并性（一个氨基酸有多个密码子）；（3）密码的通用性与特殊性；（4）密码子和反密码子相互作用tRNA的L形状的三级结构（1）tRNA的种类：1）起始tRNA：原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）；2）同工tRNA；3）校正tRNA无义突变：蛋白质合成提前终止（合成UAG、UGA、UAA），合成无功能的多肽。错义突变：结构基因中某个核苷酸变化，使得一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。（2）氨酰-tRNA合成酶：是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶。AA-tRNA合成酶既要识别tRNA，又要能识别氨基酸它对两者都具有高度的专一性。蛋白质的生物合成包括：1、氨基酸活化2、肽链的起始3、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。在真核生物中，起始氨基酸是甲硫氨酸，在原核生物中，起始氨基酸是甲酰基氨基酸。生物翻译：（1）原核生物翻译的起始：1）30SrRNA和50SrRNA相分离2）30S小亚基先与mRNA模板相结合（需要识别SD序列）3）30S小亚基再与fMet-tRNAMet（甲酰甲硫氨酸-氨酰tRNA）结合4）30S小亚基与50S大亚基结合(2)真核生物翻译的起始：1）40SrRNA与60SrRNA相分离2）40S小亚基首先与fMet-tRNAMet结合3）40S小亚基mRNA模板相结合（无需识别SD序列）4）40S小亚基与60S大亚基结合成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物(3)原核与真核的不同：1)真核核糖体较大;2)有较多的起始因子参与;3)mRNA具有m7GppNp帽子结构;4)Met-tRNAMet不甲酰化;5)mRNA分子参与形成起始复合物蛋白质前体的加工：1、N端fMet或Met的切除；2、二硫键的形成；3、特定氨基酸的修饰；4、切除新生肽链中的非功能片段。蛋白质转运分类：1、翻译-转运同步机制运输：信号链；2、翻译后运转机制运输：传导链重组DNA技术：按照人的意愿，在体外对DNA进行重组，通过导入细胞的分子，并能大量扩增和繁殖。限制性内切核酸酶：是一类能够识别DNA分子中的某种特定核苷酸的序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。基因工程技术路线：（1）获得目的基因和载体。（2）切割、连接新的重组DNA分子。（3）重组DNA分子导入受体细胞，并在细胞中复制遗传。（4）对转化子筛选和鉴定。（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。核酸凝胶：琼脂糖凝胶电泳和聚丙乙酰胺凝胶电泳。染色：适量溴乙锭（EB）。细菌转化：（1）概念：一种细菌菌株由于捕获来自供体菌株的DNA而导致性状发生可遗传性改变的过程。（2）感受态细胞：易于接受外源DNA的细胞。（3）转化的方法：电击法、CaCl2法（4）CaCl2法是制备大肠杆菌感受态（或许DNA能力增强的状态）最常用的化学方法。聚合酶链式反应技术（PCR）：定义：聚合酶链反应技术，是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。原理：PCR技术实际上是DNA体外合成放大反应。其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。①模板DNA的变性②模板DNA与引物的退火(复性)③引物的延伸○4循环原料：模板DNA、PCR引物、dNTP、Mg2+（保真）、DNA聚合酶方法：1）高温变性（解链）：94℃，5S；2）低温退火（引物与模板DNA结合）：50℃；3）适温延续（DNA合成）：72℃。实时定量PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。（1）染料：SYBRGreenI，激发波长520nm，只能与DNA双链结合，并且只有在与DNA结合时才能被激发出荧光。缺点：只能识别DNA双链而不能区分不同的DNA双链分子。TapMan探针（一端是短波长的荧光基因，一段目的DNA特异的碱基序列、另一端是长波长荧光基因。两荧光基因俱在时，荧光猝灭；而当短波长的荧光基因单独存在时，在激发光下产生绿色荧光）（2）Ct值：产物荧光强度首次超过设定阈值，PCR反应所需的循环数。基因组DNA文库：把某种生物的基因组全部DNA序列切成适当大小，分别与运载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，而克隆片段的总汇成为基因组DNA文库。RNA基本操作技术：（1）总RNA的提取：首先，裂解破碎细胞，离心除去细胞核（除去绝大部分DNA），用有机溶剂使蛋白质沉淀变性，同时抽提RNA（在水相），在抽提液中加入酚：氯仿：异物醇（25：24：1），离心后上层为水相，含有RNA，下层为有机相，变性的蛋白质和DNA位于两相界面间。吸出上层水相，在高浓度的乙醇或异丙醇作用下，离心得到RNA沉淀，即细胞总RNA。（2）mRNA的纯化：首先要从细胞中分离出总RNA，然后再从中提取mRNA。个哺乳动物细胞约含10-5ugRNA，其中80％~85％为rRNA，约15％为低分子量RNA(tRNA及核内小分子RNA等)，仅1％—5％为mRNA。虽然mRNA的大小不一致(数百至数千碱基)，核苷酸序列各异，但它们有相同的3’末端——多聚腺苷酸尾(PolyA尾)，据此可用寡聚脱氧胸苷酸(oligo(dT）—·纤维素作为亲合吸附剂，应用亲合层析法从总体RNA中分离纯化mRNA。RNA纯度测定：通过OD260和OD280来测定，OD260/OD280的值在1.8~2.0显示纯度良好，有污染则明显低于1.8。（3）cDNA的合成：反转录合成cDNA：1）合成cDNA第一链:反应体系有mRNA、反转录酶、4种dNTP及引物。引物是与mRNA3’端polyA尾互补的oligo-dT，长12到18个脱氧胸腺嘧啶。在反转录酶的作用下，以mRNA为模板可合成互补的DNA单链，即cDNA第一链。2）合成cDNA第二链:采用外加引物合成法可克隆mRNA的5’瑞，获得全长的cDNA。这是在cDNA第一链合成后，用末端转移酶在其3’尾端加oligo-dG，然后以oligo-dC为引物合成cDNA第二链。cDNA合成中，常用的引物是oligodT核酸杂交：用放射性特异DNA探针用