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专题5：DNA和蛋白质技术舞钢一高罗瑞锋DNA的粗提取和鉴定蛋白质DNA染色体1．尝试对植物或动物细胞组织中的DNA进行粗提取2．知道DNA的物理化学性质3．明确DNA的粗提取和鉴定的原理【实验目的】①DNA主要分布于细胞的什么位置？②DNA是生物大分子，怎样把它与其它物质分开，并从细胞中提取出来呢？对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质、脂质等在物理和化学性质上的差异，提取出DNA，去除其他成分。②再选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子①先破碎细胞DNA与蛋白质等生物大分子的理化性质，有何差异？DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线当NaCl溶液的浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随着随着NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L的NaCl溶液中，DNA溶解度最低。当NaCl的溶液浓度大于0.14mol/L时，DNA的溶解度随着NaCl溶液浓度的增加而逐渐增加。蛋白质等其它生物大分子，在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度，也是最低的吗？蛋白质在低浓度的盐溶液中，溶解度增高，叫蛋白质的盐溶。蛋白质在高浓度的盐溶液中，溶解度降低而析出，叫盐析。【DNA粗提取的原理】【进一步提纯DNA的原理】DNA不溶于酒精溶液，但细胞内的某些蛋白质则溶于酒精。利用该原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。95%冷酒精DNA丝状物①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响②大多数蛋白质不能忍受60～800C的高温，而DNA在800C以上才会变性③洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质，但对DNA没有影响在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色对照组：2mol/L的NaCl溶液＋二苯胺实验组：2mol/L的NaCl溶液＋DNA＋二苯胺②甲基绿（绿色）【实验流程】选材去除滤液中的杂质析出DNA鉴定DNA破碎细胞滤取含DNA的滤液菜花、香蕉、洋葱（紫色）、菠菜、豌豆、哺乳动物血细胞、鸡血细胞、猪肝、培养液中的大肠杆菌从以下材料中，选出你认为最适合用DNA粗提取和鉴定的，并说出理由？DNA含量高、易破碎、无颜色干扰的生物组织最好哺乳动物的红细胞（量大）没有细胞核，白细胞有细胞核（量少），因此哺乳动物血液中DNA含量少。1、破碎动物细胞，滤取含DNA的滤液柠檬酸钠的作用？静置分层的目的?能否用哺乳动物的血细胞，替代鸡血细胞?不好，因为哺乳动物的红细胞没有细胞核，只有白细胞有细胞核，因此哺乳动物血细胞中DNA含量低在500mL大烧杯中，加入10%的柠檬酸钠100ml,注入新鲜鸡血180mL，边加边搅拌，以免凝血。4000r/min离心2min或放入冰箱中静置1d.血细胞血浆操作：防止血液凝固获得鸡血细胞液（1）鸡血的离心（静止）分层把吸管深入瓶底，吸取鸡血细胞；转移到小烧杯中鸡血细胞液为什么用鸡血细胞液而不用鸡全血？鸡全血约含50%的血浆（没有DNA）等量的全血提取的DNA量比鸡血细胞少（2）吸取鸡血细胞液为何要，加蒸馏水并用玻璃棒沿1个方向快速搅拌？用渗透吸水的方法破碎细胞，获取核物质（含DNA）加蒸馏水快速搅拌核物质（3）破碎细胞，过滤获取含DNA的核物质滤液将制备好的鸡血细胞10mL，注入50mL小烧杯中，再加入20mL蒸馏水，同时沿一个方向快速搅拌5min，加速血细胞破裂。然后用放有3～4层沙布的漏斗过滤至1000mL烧杯中，得到含核物质的滤液。研磨：破碎细胞冷冻处理幼嫩植物材料2、破碎植物细胞，滤取含DNA的核物质滤液研磨液主要成分：SDS（洗涤剂）：使蛋白质变性，瓦解细胞膜，同时分离蛋白质与DNAEDTA（DNA酶抑制剂）：抑制DNA酶活性，防止DNA被水解。缓冲体系（Tris-HCl）加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一种离子去污剂，能溶解细胞膜有利用DNA的释放；食盐是成分NaCI，有利用DNA的溶解如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？①如果研磨不充分，会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物。②在用二苯胺鉴定时，不能显示蓝色。1、溶解细胞内的DNA和其他物质量取2mol/L的NaCl溶液40mL加入滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其中的DNA和其他物质充分溶解。向滤液中加入2mol/L的NaCL溶液的作用是什么？溶解细胞内的DNA和其他物质这时，溶液中NaCl的物质的量浓度，相当于0.14mol/L沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌。这时，烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时，停止加入蒸馏水2、析出含DNA的粘稠物（去除杂质，粗提取DNA）①沿烧杯壁缓慢加蒸馏水的目的，是什么？降低NaCl溶液浓度，使DNA溶解度降低，析出DNA粘稠物③用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌？以利于DNA分子的附着和缠绕②何时停止加蒸馏水？析出的粘稠物不再增加为止DNA有吸附玻璃的特性3、滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤出烧杯中析出的粘稠物，含DNA的粘稠物将留在沙布上。含DNA的粘稠物，为什么呈红色？还可能有哪些成分？含DNA的粘稠物不纯净，里面混有血红蛋白（红色）；还可能有其它蛋白质、多糖、RNA等杂质。还有哪些方法可以去除杂质？①滤液中加嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）处理15min左右，将蛋白质水解成小分子肽和氨基酸。②将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中，保温15min左右，使蛋白质变性沉淀。（DNA的变性温度在800C以上）怎样才能获得较纯净的DNA呢？为什么反复地溶解与析出DNA，能够除去杂质？用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低浓度的盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因而，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。①向50mL烧杯中，加入2mol/LNaCl溶液20mL，用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停搅拌3min，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中.②再向烧杯内的DNA溶液中，加入等体积95%的冷酒精，同时用玻璃棒沿一个方向不停搅拌，会出现含杂质较少的丝状物。③用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的就是含杂质较少的DNA。丝状物是一个DNA分子吗？不是，一个DNA分子的直径只有2nm1、取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。2、向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。鉴定DNA的现象是什么？水浴后出现蓝色ABA试管中加了什么？起什么作用？空白对照作用排除NaCl影响溶解DNA粘稠物析出DNA丝状物蓝色取鸡全血析出DNA粘稠物溶解细胞核物质细胞核物质滤液鸡血细胞液＋柠檬酸钠静置或离心滤液：含DNA破碎细胞破碎细胞、获得匀浆香蕉或菜花冷酒精加蒸馏水、搅拌过滤2mol/LNaCl加蒸馏水、搅拌2mol/LNaCl冷酒精过滤、离心SDS：使蛋白质变性瓦解细胞膜EDTA：抑制DNA酶活性防止DNA被水解1.5mol/LNaCl溶解DNA溶解鉴定NaCl二苯胺②蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取,没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性,摸索提取的条件，设计特定的方法。答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。①与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；因为:课本第57页第2题参考答案．