DNA在金表面的固定方法研究进展

协作网分析测试论文-DNA在金表面的固定方法研究进展时间：2007-8-27:36:29作者：admin点击：1209评论DNA在金表面的固定方法研究进展高志贤何永红（军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津300050）摘要：DNA在转换器表面的有效固定是构建DNA生物传感器的关键步骤。本文根据拟固定DNA探针的类型综述了DNA探针在金表面的固定方法，以及影响探针固定的主要因素。DNA探针固定方法主要是共价固定方法，固定液的pH和离子强度、固定探针类型和浓度等对固定效果均有影响。关键词：DNA生物传感器DNA金表面固定TheProgressofStudyonImmobilizationofDNAonGoldSurfaceHeYongHong,RenJie,GaoZhiXian,ChaoFuHuan(InstituteofHygieneandEnvironmentMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Tianjin300050)Abstract:TheimmobilizationofDNAontransferisthekeypointofmakingaDNA-biosensor.ThispapergiveareviewontheimmobilizationmethodsaccordingtothetypeofDNAprobeswhichbeanchoredonthegoldsurfaceandthemainfactorsinfluencetheimmobilization.Theimmobilizationbycovalentbondsistheprimarymethod,andthepH,ionstrength,typeandconcentrationofDNAprobecanaffecttheeffectsofimmobilization.Keywords:DNAbiosensor,DNA,goldsurface,immobilization核酸是重要的生命物质，其保存和传递生物遗传信息的独特方式，即特定的碱基序列和碱基配对的原则，是体外研究核酸功能和核酸检测方法的基础。用脱氧核糖核酸（DNA）作为识别元件构建的DNA生物传感器，在核酸检测中可以排除对标记的需要，同时具有在液相中快速、实时测定的优势，适合发展成为一种定量测定的自动装置[1]。在DNA生物传感器的构建中，DNA探针在转换器表面的有效固定是传感器能够进行准确检测的前提。固定应该使DNA保持原有生物活性，不易脱落，并易于与靶物质接触。根据转换器的性质，运用不同的方法将DNA探针固定在其表面。本文主要综述近年来在金表面固定DNA探针的研究成果，根据拟固定的探针是否需要修饰及如何修饰，将固定方法进行分类综述。1修饰DNA探针的固定随着生物化学合成技术的发展，目前可以通过商业途径购买到按要求修饰的合成寡核苷酸，修饰方式主要是在DNA的末端连接含硫化合物、生物素和氨基等，再通过这些基团将DNA探针固定在金表面。1.1含硫化合物修饰的DNA（HS-ssDNA或-SS-ssDNA）探针的固定已知许多含硫的化合物，如硫醇和二硫化物等，能够通过Au-S之间很强的化学键合力（键能高达184KJ/mol）在金表面自组装形成薄而有序的单分子层[2]。这种自组装层紧密有序，具有较好的机械和化学稳定性[3]。含硫化合物修饰的单链DNA（ssDNA）在金表面的固定就是基于上述原理。最常用的修饰剂是含1个硫原子的化合物（如6-巯基己烷）[4,5,6]，也有含2个硫原子的化合物[7,8]。一般采用修饰探针直接处理金表面的方法固定，也有通过胶体金固定的方法，见示意图1。1.1.1探针直接处理金表面的固定方法洁净的金表面用探针溶液直接处理，作用一段时间后除去未固定的探针，用其他巯基化合物（如巯基己醇）进行封闭，这样就将探针牢固地固定在金表面，可用于DNA杂交反应，固定原理见图1（a）。Mannelli等[4]用这种方法将探针固定在石英晶体微天平（quartzcrystalmicrobalance,QCM）金电极表面，研究用于检测转基因生物中特定基因片段的方法。结果显示，这种方法固定探针是成功的，在固定条件尚未优化的情况下，该方法的变异系数（CV）是15%。Wang等[9]用巯基修饰的肽核酸（peptidenucleicacids,PNA）处理QCM金表面，结果显示87%的金表面被PNA覆盖，重复性实验的CV为18%，显示固定具有较好的重复性。杂交实验具有很好的特异性，可以检测单个碱基的错配。Okahata等[7]用β-(羟乙基)二硫乙氧基修饰的探针处理QCM金表面，在处理过程中监测频率变化，当频率降低约100Hz时，终止固定过程。根据频率质量关系，计算出30%的金表面被探针覆盖。通过Au-S键的固定非常牢固，将电极浸泡在缓冲液中24h，难以将固定探针从QCM上除去[7]。1.1.2通过胶体金的固定方法胶体金是一种纳米金颗粒，表面积大并具有良好的生物相容性，在构建DNA生物传感器中具有重要的作用。通过两端带有硫原子的双功能化合物可以将胶体金固定在金表面，探针通过Au-S键固定在胶体金上，这种方法较直接处理方法复杂，但胶体金具有较大的表面积，可以大大提高探针的固定量。Lin等[10]通过1,6-己二硫醇在QCM金表面自组装形成外端为巯基的单分子层，胶体金与外端巯基结合，固定在金表面。在胶体金的固定过程中，可以观察到胶体金溶液的颜色从深红色变成无色，说明胶体金被有效地吸附到金表面。探针溶液与覆盖胶体金的金表面作用，通过自组装固定在胶体金颗粒上。实验显示，胶体金修饰的QCM上探针的吸附率和饱和吸附量均比裸金QCM大得多，固定探针的量随胶体金的增加而呈线性增加，因而可以通过控制胶体金的量来调整探针的固定量。杂交实验显示，在靶浓度一定的情况下，胶体金修饰的QCM的频率变化是不修饰的4倍，大大提高了检测灵敏度。他们比较了不同的含硫化合物，如胱胺、半胱胺和1,6-己二硫醇在金表面固定胶体金的能力，结果显示，1,6-己二硫醇具有明显的固定胶体金的能力，胱胺和半胱胺没有显示固定胶体金的能力，但原因尚不清楚。Cai等[5]的研究则显示，半胱胺修饰的金表面可以吸附胶体金颗粒。他们测定计算出裸金电极、半胱胺修饰电极和胶体金修饰电极的表面积分别为0.045cm2、0.049cm2和0.11cm2，很明显，胶体金使金电极的有效面积增大了约2.5倍，大大增加了可以固定ssDNA的面积。比较同一探针在裸金电极和胶体金修饰电极上的吸附行为，在吸附开始的1小时，探针在胶体金修饰电极上的增加比在裸金电极上的增加快得多，显示在胶体金修饰电极上固定探针更容易，且探针在胶体金修饰电极上的饱和固定量是在裸金电极上的10倍，因此所构建的电化学DNA传感器的检测限，也提高了10倍，并有很好的特异性和重复性（CV=3.6%）。胶体金的应用使固定探针的表面积大大增加，增加的探针固定量使杂交容量大大提高，从而改善DNA生物传感器的灵敏度。含硫化合物修饰的探针在金表面固定的原理明确，操作简单。但有人认为巯基化探针直接结合到金表面，DNA链之间会有强烈的相互作用，DNA可能在金表面以平躺的方式存在，不利于与溶液中互补DNA链杂交[11]。关于此类探针在金表面固定的确切形态，尚无直观的图象证据。1.2生物素修饰的DNA（biotin-ssDNA）探针的固定生物素分子易于活化，与核酸分子偶联率高且不影响核酸的生物活性，通过能与生物素特异性结合的亲和素或链亲和素（avidinoratreptavidin）作为桥梁，将DNA固定在金表面。用亲和素作为桥梁，首先要将亲和素固定在金表面，根据亲和素的固定方式不同，可以大致分为如下几类：1.2.1亲和素固定在羧基修饰的金表面在金表面修饰羧基，通过羧基与亲和素中的氨基反应形成酰胺键，将亲和素共价固定在金表面，再通过亲和素与生物素之间的相互作用，将biotin-ssDNA固定在金表面。用3,3’-二硫二丙酸（3,3’-dithiodipropronicacid,DDPA）处理QCM金电极，DDPA通过分子中的硫原子在金表面自组装形成外端为羧基的有序单分子层，通过共价偶联活化剂N-乙基-N’-(3-二甲胺丙基）碳二亚胺（N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride，EDC）和琥珀酰亚胺（N-hydroxysuucinimide,NHS）活化羧基，使羧基与链亲和素分子中的氨基发生缩合反应，将链亲和素共价固定在金表面[7,12,13],固定过程见图2。固定探针的电极只在与互补DNA作用时有明显的频率变化，显示出很好的特异性。Tombelli等[14]利用同样的原理在QCM金表面固定biotin-ssDNA，但他们的操作步骤较为复杂，首先用11-巯基十一醇处理金表面，羟基化表面用表氯醇处理后用碱性右旋糖苷溶液处理，最后用溴乙酸处理使表面修饰羧甲基基团，羧甲基用NHS和EDC活化后，与链亲和素作用，使链亲和素共价固定在金表面。1.2.2亲和素固定在生物素修饰金表面在金表面预先吸附一层生物素分子，亲和素通过与生物素的结合固定在金表面。由于一个亲和素有4个生物素结合位点，因此结合的亲和素还可以与biotin-DNA结合，从而以一种生物素/亲和素/生物素的三明治式的方式将探针固定在金表面。Kukanskis等[15]用生物素化蛋白质处理金表面，通过蛋白质在金表面的吸附将生物素固定。他们使用流动注射装置，使生物素化小牛血清白蛋白溶液、链亲和素溶液和biotin-ssDNA溶液依次流过金表面，从而形成生物素/亲和素/生物素的固定结构。这种固定方法简单，蛋白质虽然不是共价结合在金表面，但实验结果显示，蛋白质层可以稳定20h，在超过12h的杂交过程中，分子的脱落是可以忽略的。Su[16]在QCM银表面滴加聚苯乙烯（polystyrene，PS）甲苯溶液，使表面形成均匀的、厚约0.8μm的PS薄膜，在此薄膜上滴加光生物素溶液，用紫外灯照射形成稳定的光生物素薄膜，用亲和素溶液处理后，与biotin-ssDNA溶液作用，待频率变化达到最大并稳定后，固定的探针即可用于杂交实验。他们用X-射线光电子能谱（XPS）对电极表面进行了分析，谱图显示电极表面光生物素化和随后的亲和素固定是成功的，这种在银表面固定亲和素的方法也可以用在金表面。1.2.3亲和素固定在负电聚合物修饰的金表面亲和素的等电点为10.0-10.5，在中性环境中分子带正电，可以通过与带负电的物质之间的静电相互作用固定在负电聚合物修饰的金表面。Caruso等[12]用3-巯基丙酸处理QCM金表面，然后用聚丙胺盐酸盐（poly(allylaminehydrochloride)，PAH)处理，使表面形成带正电的聚合物薄膜，在此薄膜上沉积带负电的聚苯乙烯磺酸盐（poly(styrensulfonate),PSS），吸附带正电的亲和素，亲和素再吸附PSS，如此反复，在金表面形成一个4层PSS和5层亲和素的夹心多层膜。实验结果显示，这个多层膜固定的探针与靶DNA杂交的速度比单层慢，说明发生了靶DNA渗透进入膜内。杂交反应具有较好的特异性，且杂交引起的频率变化是单层膜的4-5倍，显示在靶DNA浓度一定时，构建多层探针可以提高检测灵敏度。生物素与亲和素结合速度快，它们之间的非共价相互作用的亲和常数高达1015/mol，形成的复合物非常稳定，溶液pH的变化和一般的操作，如多次洗涤等，不会影响其稳定性[14]。生物素-亲和素系统的另一个优点是具有放大作用，一个亲和素可以连接4个生物素，有利于固定更多的探针，提高杂交容量，因此，在探针的固定中，该系统受到广泛的重视。但这种固定方法需要对金表面进行多次处理，操作较为烦琐，且整个过程必须在液相中完成，因为亲和素一旦干燥，就会变性失去活性，丧失与生物素相互作用的能力。此外，这种方法的成本也相对偏高，对于应用推广可能有一定的影响。1.3氨基修饰的