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特殊染色及组织化学赣南医学院病理学教研室第一节特殊染色及组织化学的基本知识一、染色方法1863年由waldeyer率先倡导用苏木素染液染细胞核，后来Mallory、Mayer等也阐述过苏木素的应用。近年来特殊染色和组织化学方法也屡有创新。Shikata(1973)，Tanka等(1981年)分别介绍了用地依红和维多利亚蓝混合液显示乙型肝炎表面抗原的方法；1987年CrockerJ等推出了核仁组成区嗜银蛋白染色的技术方法以及1991年进行的乳腺肿瘤核仁组成区的研究方法等。二、染色目的未加染色的任何组织切片在镜下只能辨认细胞和胞核的轮廓，看不清楚其他任何结构。染色的目的就是将组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间，将组织或细胞及其他异常成分染上不同深浅的颜色，便于在光学显微镜下进行观察。三、染色原理染色过程是染色剂和组织细胞相结合的过程。其机理尚未完全清楚。1、有学者认为从物理学角度看，染色剂和组织细胞的结合是“溶解”或“吸收”。例如苏丹类染色剂使脂质着色，就是利用染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度这一特性。有些染色剂是染色剂分子通过渗透和毛细血管作用而被吸收或沉淀到组织、细胞的小孔中去而着色的‘这种机制的染色是很少的。2、另有学者认为染色是染色剂与组织、细胞之间的化学性结合。如显示含铁血黄素的普鲁士反应是最典型的例子。但是，大量染色的化学反应并不象铁反应那样明确。大多数染色的原理至今仍未搞清楚，有些可能是物理性的，有些可能是化学性的，有些则可能2种机制都起作用。正因为人们对染色的原理还没有完全掌握，所以还不能很好地运用原理来控制它，在相当程度上需凭工作经验。四、染色的分类(一)普通染色最广泛应用于常规制片的苏木素和伊红染色，又称为常规染色。(二)特殊染色1．定义专门用于显示某些特定目的物的染色方法称为“特殊染色”，它又可以理解为“选择性染色”。特殊染色对目的物的选择性是相对的。有些方法具有相对的特异性，如油红O等脂质染色，显阳性者可以肯定为脂质；有些则显示的是一类物质，如PAS呈阳性反应者有糖原、粘蛋白、网织纤维、软骨、阿米巴原虫、霉菌等许多物质和组织结构，并不能确定是哪一种具体成分。所谓特殊染色的相对性，就是一种方法可以显示多种目的物，一种目的物可以用多种方法显示，其中有些方法可能呈阳性，而有些方法则呈阴性，这就需要我们拿捏多种方法，因为有时只有依靠多种方法才能确定所要确认的目标。2.特殊染色的分类特殊染色方法按照所染目的物进行分类，有结缔组织、肌肉组织、神经组织、脂类物质、糖类、色素、病理的内源性沉着物、病原微生物、内分泌物质、骨、血液及造血组织、核酸、酶类等。3.特殊染色的命名对于特染的命名至今尚无统一的规定，多数均按发明者的姓名命名，如vanGeison染色等；有的则按所用染色剂命名，如甲基绿一派若宁染色、苏丹Ⅲ染色等；有的按目的物命名，如网织纤维染色；还有的采用混合命名，如试剂十人名等。4．特殊染色的意义1)显示在常规HE染色切片中不明显的目的物,如病变中霉菌数量较少时，应用Gridley染色就容易发现2)可以区别胶原纤维和平滑肌，苏丹染色可区别脑浆内的脂肪变和水样变。3)可以显示某些HE染色中不能看到的目的物。如网织纤维、星形细胞的突起、结核杆菌、螺旋杆菌等，都可用相应的特殊染色法显示。因此，特殊染色是常规染色的必要补允，也是染色技术中不可缺少的组成部分。它在病理诊断中起着辅助作用。五、组织化学的基本概念组织化学是在形态学基础上研究细胞或组织中物质的化学组成、定位、定量及代谢状态的学科，是组织学与生物学及生物化学等的边缘科学，其目的是联系形态，化学成分和功能来了解组织或细胞的代谢变化。目前有许多组织化学方法已划入特殊染色，划分特殊染色和组织化学无绝对界限。六、方法和种类1、化学方法根据其化学反应的原理，在组织切片上生成沉淀，显示定位。2、类化学方法有少数方法的染色反应有特殊性，但机制不明。3、物理方法应用物质的物理学特性，如苏丹、油红染料易溶于脂类而使脂类染色。七、操作掌握的要点1．组织材料及时切片与染色，才能保持组织细胞良好的形态结构。2．染色切片的判断，应把病变的形态、部位及相应的理论一起进行综合分析，可借助阴性及阳性对照，正确分析实验结果。3．生成的反应产物必须在原位沉淀，着色深，且不溶，为细小沉淀或小结晶。能保证定位的精确性及稳定性，便于反复观察。1.虽然形成了许多显示细胞化学的方法及一些特殊染色。但发展的速度比较缓馒。这是因为每一种方法都有自己不相同的试剂、底物和方法，在发展上既没有系统的经验可以遵循，在学习使用上也比较困难。2.自从免疫组织化学问世以来．几乎所有的组织化学成分都可以用免疫组织化学方法检测，所以组织细胞化学的许多方法大多数被免疫组织化学所代替。3.有些组织化学方法定性准确，方法简单、使用方便或因试剂便宜，至今沿用不衰。第二节糖原和粘液物质染色一、糖原糖原在肝细胞、心肌细胞、骨胳肌细胞内含量最多，其次是毛囊、子宫腺体、阴道上皮、脐带等处均有少量糖原存在。糖原易溶于水，在酶的作用下容易分解为葡萄糖。葡萄糖更易溶于水，故机体死亡后糖原易受到破坏，其含量发生明显变化甚至完全消失。用常规HE染色观察不到糖原的形态，用显示糖原的特殊染色也难以观察到糖原的形态及分布。所以为了观察和研究组织内糖原的含量及分布、必须选取新鲜标本，用能保存糖原的固定液及时固定，再经特殊染色后才能将糖原显示出来。(一)固定方法及注意事项1)尽可能选取小块新鲜组织并及时固定。2)多次更换乙醇混合固定液，在4℃左右内固定与保存。这是针对糖原的性质和避免糖原溶于水而采取的相应措施。乙醇虽然是保持糖原的较好固定剂，但是用单一的乙醇尤其是用无水乙醇固定肝、肌肉等实质性组织时，固定作用迅速而穿透力弱，组织表面会很决凝固变硬。这样由于固定不透和不均，糖原同样不能得到较好的保存，易出现糖原颗粒趋于细胞一端的极化现象。目前固定与保存糖原的固定液，以乙醇为溶剂配制含甲醛、冰醋酸及苦味酸等混合固定液为好：此类固定液利用乙醇防止糖原溶解于水；利用冰醋酸和苦味酸的膨胀及软化作用，抵消乙醇对组织的收缩硬脆；利用甲醛对组织固定的渗透力强、固定均匀等优点。其固定原理是使与糖原相结合的蛋白质凝固。(二)常用固定液1．Gendre固定液苦味酸无水乙醇饱和溶液(约8.96％)80ml，甲醛(38％一40％)5ml，冰醋酸5ml。临用前配制。取小块组织置于4℃冰箱内固定1—4小时，固定期间更换2—3次新液。固定前组织禁用水洗，直接用80％乙醇浸洗数次后，至95％乙醇开始脱水。2．Lillie固定液(AFF)无水乙醇85ml，冰醋酸5ml，甲醛(38%一40%)10ml。此液为优良的固定液。配制及使用方法与Gendre固定液相同。固定后组织可直接用95％乙醇开始脱水。3．Rossman固定液苦味酸无水乙醇饱和液90ml，甲醛(38％一40％)10ml。临用前配制，取小块新鲜组织于4℃冰箱内固定1—2d，更换2—3次新液，然后在室温下用95％乙醇浸洗数次，经无水乙醇脱水。(三)糖原染色应用1．细胞内泡状变性的鉴别在常规石蜡切片的HE染色中，如胞浆内出现大小不等的空泡，应考虑可能是脂肪变性，经脂溶剂的脱水透明过程溶解而形成的空泡；也可能是糖原在经水溶液固定过程中的脱失所致；或可能是单纯的水样变性。为了鉴别其性质，则需要用显示糖原或脂质染色法加以证明。2．在心肌病变及其他心血管疾病的研究用显示糖原的特殊染色，可以观察到由缺血缺氧所致急性早期心肌坏死病灶内的糖原明显减少甚至消失，呈均质的浓染状态，而病灶周围则出现反应性异常糖原增多；已愈合的心肌梗死灶周围的心肌纤维内可有糖原颗粒浸润；心肌的横纹肌瘤也有大量糖原存在。3．糖原累积病的诊断及研究用显示糖原的特染方法可观察到由先天性遗传缺陷引起的糖原累积病时，心、肝、肾、骨骼肌、单核吞噬系统等器官内均有大量的糖原堆积。4．糖尿病诊断及研究在患糖尿病时，肝细胞、肾曲小管上皮细胞、心肌纤维内均可见糖原颗粒沉着，其含量的多与少和血糖水平呈平行关系。5．用于某些肿瘤的诊断与鉴别①鉴别肝细胞癌与胆管癌、前者糖原染色为阳性，后者为阴性；②鉴别横纹肌瘤与颗粒细胞母细胞瘤，前者为阳性，后者为阴性；③骨尤文氏瘤、汗腺瘤、横纹肌肉瘤、化学感受器瘤、脊素瘤等，用糖原染色均可显示为阳性。(四)显示糖原的方法1.Best胭脂红染色2.过碘酸雪夫反应法(PAS)3.Bauer铬酸雪夫反应过碘酸雪夫反应(PAS)此法能显示糖原，而且还能显示中性粘液性物质和某些酸性粘液性物质以及软骨、脑垂体、霉菌、脂质、色素、淀粉样物质及基底膜等。故PAS法在病理学上可用于多种疾病的研究。其染色原理为：过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的l，2一乙二醇基，使之变为二醛；醛与Schiff(雪夫试剂)结合生成—种品红化合物，即形成红色取代色素而得到定位。染色步骤I)石蜡切片3—5μm，脱蜡至水洗。2)蒸馏水洗1—2min。3)用1%过碘酸水溶液氧化5—10min。4)充分水洗。5)蒸馏水洗涤数次。6)用Schiff试剂浸染5一10min，如温度低时可延长浸染时间。7)倾去Schiff试剂，直接流水冲洗10min。8)用明砚苏木素染液浅染胞核2—3min，过染时可用o5％盐酸乙醇液稍分化。9)流水冲洗5一l0min。10)乙醇脱水，二甲苯运明，中性树胶封固。注意事项1)过碘酸的浓度在o．5％一2％范围内，其染色结果无显著差异，但一般多采用在0.5%一1%的浓度、其PH为3—5之间。2)用过碘酿液氧化时的温度及作用时间值得注意。若温度高、作用时间长可使某些物质成分发生非特异性反应，结果会出现假阳性，以其氧化时间应控制在5一10min、环境温度不高于20℃为宜，室温稍高时其氧化时间应适当缩短。3)配制雪夫试剂的方法很多，其基本原理都是将碱性品红与亚硫酸氢钠等作用，变成无色终产物，故较为理想的雪夫试剂应为无色透明溶液。当贮存的溶液变为橘红色或粉红色时，即说明已变质失效而不能再用。4)亚硫酸氢钠冲洗液必须在临用前配制，用过的或放置后溶液不能再用。经此液作用后，PAS阳性物质显红，以淡染为宜。5)复染核不要过深，应淡染为宜。二、粘液物质人体各种腺体及其他组织、细胞所分泌的粘液类物质大体上相似，统称为粘液。按其化学结构和物理状态的不同，粘液物质由粘多糖和粘蛋白组成。⒈粘多糖粘多糖包括：1、酸性粘多糖2、中性粘多糖两者均以氨基已糖为主要成分。⒈粘多糖1)酸性粘多糖：其基质成分以硫酸性和唾液酸性2种形式存在，广泛地分布于全身各处。正常生理情况下，主要存在于消化道、呼吸道及其他部位的粘液腺分泌物中，在滑膜、玻璃体、角膜、脐带等处尤为丰富，硫酸软骨素和肝素为复杂的酸性粘多糖。硫酸软骨素分A、B、C3型，存在于软骨、结缔组织、肌腱、血管和皮肤的基质内；而肝素则存在于肥大细胞的胞浆中。2)中性粘多糖：主要存在于胃粘膜表面上皮、幽门腺、十二指肠的勃鲁钠腺等处，不如酸性粘多糖分布广泛。⒉粘蛋白粘蛋白是由糖和蛋白质相结合而构成，故又称糖蛋白。见于各种组织上皮和腺体导管的分泌物中，在垂体前叶的嗜碱性细胞所含促生殖腺激素和促甲状腺激素中也可见到粘蛋白，还有一些存在于血清中。⒉粘蛋白在同一种上皮和腺体内常可同时分泌2种粘液物质，而在同部位的分泌物中两者的比例和含量都有所不同。⒉粘蛋白粘液物质一般具有下列性质：①对异染性染料具有异染性；②对碱性染料具有很强的亲和力；③除胃粘蛋白外，其他粘液遇醋酸时都会发生沉淀；④可溶于弱碱性溶液。㈠粘液染色的应用⒈用于一般粘液性病变的观察在病理状下，结缔组织、肾等一些实质性脏器，可出现粘液水肿、粘液变性和粘蛋白的增多。常规HE染色，粘液呈污秽和淡蓝色，很不清楚，如用粘液物质染色可以得到满意的结果。㈠粘液染色的应用⒉肿瘤的诊断和鉴别诊断⑴胃癌在粘膜表面上皮和癌组织内均可见到呈阳性反应的粘液物质。同时还可证明癌细胞是否浸润到间质中；粘液染色对观察肠上皮化生也是很有意义的。⑵对肺部某些肿瘤的观察。⑶粘液瘤和粘液肉瘤用粘液