酒精发酵工艺

酒精发酵工艺石贵阳江南大学2010.04一前言酒精发酵工业是一个大宗底物需求的工业厨余垃圾、办公废纸等淀粉类原料糖质原料纤维质原料谷物类薯类玉米、大米、小麦等木薯、甘薯、马铃薯等甘蔗、甜高粱、甜菜、糖蜜等农业废弃物木材业副产物城市废弃物秸秆、谷壳、牛粪等木屑、刨花、枝叶等发酵原料二酒精发酵基本过程•酒精发酵属于厌气性发酵，在发酵过程中进行无氧呼吸，醪液中的一部分可发酵性糖和氮等营养物质被酵母吸收合成菌体细胞，大部分糖则被发酵生成酒精和CO2•酒精发酵过程可以分为三个不同阶段前发酵期主发酵期后发酵期•醪液中的酵母细胞数不多，酵母菌迅速进行繁殖；•接种时温度控制在26－28℃，整个前酵过程一般不超过30℃；•酒精和CO2生成量很少，发酵醪的表面比较平静，醪液温度上升不快，糖分消耗慢；•前发酵延续时间一般为10小时左右；•前发酵期间应十分注意防止杂菌污染；2.1前发酵期•醪液中酵母细胞数可达1亿/毫升以上，酵母菌基本上停止繁殖，主要进行酒精发酵•醪液中糖分迅速下降，酒分逐渐增多，醪液中产生了大量的CO2•发酵醪温度上升快，最好能控制在30-34℃•主发酵时间一能般为12小时左右2.2主发酵期2.3后发酵期•发酵液中的可发酵性糖浓度持续降低最终维持在极低水平，发酵作用缓慢，酒精和CO2的生成量也相对较少•发酵产生的热量减少，应通过保温方式控制醪液温度在30-32℃•淀粉质原料生产酒精的后发酵阶段一般约需40小时左右三酒精发酵工艺间歇式发酵半连续发酵连续发酵一次加满法分次添加法连续添加法分割主发酵醪法循环连续发酵法多级连续发酵法双流糖化和连续发酵酒精发酵工艺3.1间歇式发酵工艺•一次加满法•分次添加法•连续添加法•分割主发酵醪法3.2半连续发酵工艺（1）一种是将一组数个发酵罐连接起来，使前三个罐保持连续发酵状态，然后从3号罐依次分别流入其余发酵罐。即第四罐施加满后，改流至第五罐，第五罐满后改流至第六罐，依次类推。第四、五罐发酵结束后，送去蒸馏。洗刷罐体后再重复以上操作。•第二种是由7－8个罐组成一组罐，各罐用管道从上部通入下一罐底部相串连。投产时，先制备1/3体积的酒母，加入第一只发酵罐，随后在保持主发酵状态下，流加糖化醪；满罐后，流入第二罐，待第二罐醪液加至1/3容积时，糖化醪转流加至第二罐；第二罐加满后，流入第三罐，然后重复第二罐操作，直至末罐；最后从首罐至末罐逐个蒸馏。3.2半连续发酵工艺（2）3.3连续发酵工艺（1）•循环连续发酵法•多级连续发酵法全封闭自流式连续发酵工艺1、2、3－后熟器4－汽液分离器5－糖化锅6－热水器7－喷淋冷却器8－酒母罐9－45m3发酵罐10－35m3发酵罐11－32m3发酵罐12－30m3发酵罐13－泡沫发酵罐14－CO2洗涤器15－泵3.3连续发酵工艺（2）双流糖化和连续发酵蒸煮醪按两种糖化方法进行。第一种方法在58－60°C条件下糖化50－60分钟；第二种方法在真空条件下60°C糖化5－6分钟。2/3的糖化酶加入第一种糖化器中，其余1/3加入第二糖化器内。经第一种糖化器糖化的醪液流入主发酵罐内，而从第二糖化器流出的糖化醪送入其它发酵罐内。酵母接种量按主发酵容积的25％加入，发酵至第8、9罐结束(每组由12个罐组成)，成熟发酵醪酒精含量为8.42－8.76％(v/v)，残糖0.22－0.26％，其中可发酵性残糖仅0.1％。3.3连续发酵工艺（3）双流糖化和连续发酵示意图1、2－糖化器3、4－冷却器5、6－第一、二主发酵罐7、8－发酵罐3.3连续发酵工艺（4）连续发酵的优点•提高了设备利用率•提高了淀粉利用率•节省酒母工段•便于实现自动化3.3连续发酵工艺（5）四制备高性能高活力酒精酵母的研究•4.1新型酒精酵母活力评价方法•4.2新型工业酒精酵母的构建4.1新型酒精酵母活力评价方法•在细胞培养的过程中，经常需要对细胞的活力进行观察检测，以了解培养物的生长状况。细胞活力的检测在发酵工业中主要用于种子的筛选与其质量评估、培养过程中细胞生理状态的跟踪等。•如何对酵母的活力进行准确、快速的评价，是近几年来国内外一直致力的研究课题。酵母亚甲基蓝还原实验法染色法血球板计数法菌落计数法镁离子释放法活力滴定法酸化力法•为了控制发酵，啤酒厂一直沿用血球计数板计数的方式进行酵母细胞的计数，这种方法虽然简单，但人为因素多，误差大。此外，只计细胞数而不知其活力，无法反映出发酵过程中酵母细胞的真实生理状况•而酵母细胞数、出芽率、死亡率、耗糖率等传统方法准确度较低，检测周期较长，无法实现实时监控。•酵母质量的检测方法虽多，但一般可以根据检测指标的不同，主要分为四类：细胞繁殖能力检测、细胞生理指标检测、细胞膜完整性检测与染色法。•这些检测方法中，国内外研究最多的为胞内pH法、镁离子释放法与酸化力法检测指标检测方法A.细胞繁殖能力检测细胞繁殖能力荧光显微镜检测或流式细胞仪检测集落形成能力平板菌落计数法B.细胞生理指标检测胞内ATP浓度荧光素酶试剂盒法，荧光测定琥珀酸脱氢酶（SDH）检测SDH活力H+释放能力胞内pH法Mg2+释放能力Mg2+释放法肝糖含量与糖酵解速率酸化力法细胞脱氢酶的活力MTT还原能力测定荧光测定法检测细胞氧呼吸活性氧消耗速率（OUR）法C.细胞膜完整性检测胞内蛋白质或核酸染色活细胞台盼蓝等的拒染法D.染色法结晶紫染色法亚甲基蓝染色法细胞活力的检测分类胞内pH法•胞内pH法是根据氢离子释放能力来衡量酵母活力的大小，具有较高氢离子释放能力的细胞，其活力较高。•研究表明胞内pH不仅可以反映出酵母活力的大小，也与发酵性能有密切关系，内pH值高的酵母菌，活力高，发酵性能好。•此法所用仪器及试剂都比较昂贵，因此不能作为化验室常规的检测内容。镁离子释放实验•在发酵状态良好的情况下获得的酵母泥接种麦汁培养基后对这些离子的利用过程是先释放，再吸收，相反，在较差发酵状态获得的酵母泥接种后则缺少了离子的释放过程。•使用通用的镁离子测试试剂包即可对酵母泥接种前后的麦汁中镁离子进行定量的比色分析，快速检测酵母活力。•不足之处：①离心后每一批酵母泥含有的水分不同，导致称取0.1g酵母泥时会有误差。②实验中镁离子测定试剂会受到钙离子等无机离子的干扰。酸化力法•酸化力测定是指在待测样品悬浮液中添加葡萄糖，测定添加前后胞外pH的变化。胞外pH值的降低是由酵母H+释放引起的，与CO2的排出、有机酸、K+/H+转换及原生质膜中ATP酶的作用有关。•酸化力检测虽能准确预测发酵性能，然而这种方法不适用于那些使用酸洗或者酸调理的酵母细胞样品，如果要保证实验结果的准确，需要用去离子水将酵母细胞表面清洗干净。亚甲基蓝还原实验•亚甲基蓝会被位于微生物细胞膜上的还原酶还原成一种无色的物质，该物质是无电荷的、亲脂的并且可以通过细胞膜进入细胞中，在细胞中再次被氧化。•在乳品加工业中，亚甲基蓝还原实验经常被用来检查牛奶中微生物的含量。•2005年，亚甲基蓝还原实验被用在大肠杆菌培养过程中，可以准确反映培养过程中细胞数目的变化。①是否可反映出酵母的活性；②酵母活力的表示方法；③测定条件；④灵敏性（应用范围）；⑤与酸化力法(AP法)相比，可否准确反映出酵母活力。需要确定的问题：T1/2值的定义0501001502002500.000.050.100.150.200.250.300.35吸光度660nm时间(s)A1A2A1/2T1/2A1：亚甲基蓝初始吸光度A2：亚甲基蓝最终稳定时的吸光度A1/2：A1与A2的吸光值的平均值根据A1/2的值通过线性关系可计算出T1/2。亚甲基蓝吸光度随时间变化的曲线•当新鲜酵母含量在40%以上，其活力和T1/2值具有完全的关联度，R2=0.9388；•当T1/2值大于250时，混合细胞中已含有60%的死细胞，表示酵母细胞的活力已经很低，完全不能用于酒精发酵。•在进行酒精发酵过程中，完全可以利用亚甲基蓝还原实验来追踪发酵过程酵母质量的变化及判断发酵终点。不同活力酵母的亚甲基蓝还原实验检测条件②亚甲基蓝浓度与酵母浓度的选择①pH的选择01002003004005000.000.050.100.150.200.250.300.35A时间(h)pH4.5pH6.5pH8.5pH10.5随着亚甲基蓝浓度的增加，体系的吸光度值增大，仪器误差增大，为了使实验有较高的灵敏度，本实验选用亚甲基蓝的浓度为8mg/L。酵母浓度太大时导致亚甲基蓝的初始吸光度改变，且导致褪色速率增加，使实验具有低的灵敏性，太低时导致活力与MB还原反应成非线性关系。本实验中酵母浓度为2.5%。图1pH对亚甲基蓝还原反应的影响MBRT的灵敏性实验01002003004005006000.000.050.100.150.200.250.300.35A660时间(s)100%80%70%66.7%60%50%40%A0200400600800100012000.000.050.100.150.200.250.300.35A660时间(s)33.3%25%20%0%B图2不同活力酵母的亚甲基蓝还原反应新鲜细胞含量(%)204060801000100200300400500600700800T1/2(s)y=-7.312x+677.54R2=0.7582C新鲜细胞含量(%)4050607080901006080100120140160180200220240T1/2(s)y=-2.8334+347.88R2=0.9388D时间(s)0102030405060708005101520253035OD600OD2.22.42.62.83.03.2APAP406080100120140160T1/2T1/2(s)但在测量时AP值受到酵母洗涤次数，搅拌转速，温度等因素影响，与酸化力法相比，亚甲基蓝还原实验是一种简单，快速，准确测定酵母活力的一种方法。培养过程中酵母活力的变化从图中T1/2值与AP值可以看出酵母生长经过延滞期、对数期、稳定期与衰亡期。木薯渣培养酵母试验中监测酵母活力051015202530050100150200250300T1/2T1/2时间/h024681012ODOD010203040506070残糖量/g/L残糖量酵母培养过程中酵母活力的变化（木薯渣原料）•在培养过程中，从OD及残糖量数据并没有看出酵母活力低；•从T1/2值可以看出，在对数前期，酵母新陈代谢旺盛，酵母活力较高，在对数后期，酵母活力下降较快；•在进一步的试验中，还发现在木薯渣中加入适量的氮源及合适的离子可培养出活力较高的酵母。表3添加不同离子对酵母各指标的影响组数添加离子OD耗糖率/%T1/2/s1Na+K+Mg2+5.13a48.74a99.41a2K+Mg2+4.66b48.74a96.47a3K+Mg2+Ca2+4.60b43.40b104.52a4Na+K+Mg2+Ca2+4.56b41.51b104.78a5Na+Mg2+2.50c33.96c175.05b6Na+Mg2+Ca2+2.35c12.58f164.80b7Na+K+Ca2+1.95d12.58f177.96b8Na+K+1.73e30.19d140.67b9Mg2+Ca2+1.05f8.61g177.1b10K+Ca2+1.05f7.55g185.39b11Na+Ca2+1.01fg16.35e153.61b12空白0.87g18.87e164.80b注：同列数据后具相同小写字母者表示在0.05水平上差异不显著。无机离子对酵母生长的影响蛋白胨对酵母生长的影响01020304050100150200250300350400450010203040503.03.54.04.55.05.56.0010203040506001020304050600102030405004812162024CB空白0.1g/L蛋白胨0.5g/L蛋白胨2g/L蛋白胨4g/L蛋白胨8g/L蛋白胨10g/L蛋白胨15g/L蛋白胨20g/L蛋白胨25g/L蛋白胨T1/2(s)时间(h)AD时间(h)pH残糖(g/L)时间(h)时间(h)OD酵母膏对酵