搜索
基因重组与基因工程1、基因重组：指不同来源的DNA在细胞内重新进行组合，并能进行复制、转录、翻译的过程。2、基因工程：在体外用人工的方法进行基因的重新组合，再把重组基因导入到细胞或细菌内进行复制、转录、翻译的技术。第一节自然界的基因转移和重组‘无目的’-自然界的基因转移和重组自然界不同物种和个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。‘有目的’-基因工程第一节DNA的转移和重组（DNAtransfersnfrecombination)DNA重组包括：同源重组（homologousrecombination)特异位点重组（site-specificrecombination)转座重组（transpositionalrecombination)一、同源重组（基本重组）发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。为最基本的DNA重组方式，在原核、真核生物均发生。二、位点特异性重组（site-specificrecombination）由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称～。此过程往往发生在一个特定的短的（20～200bp)DNA序列内（重组位点），并且有特异的酶和辅助因子对其识别和作用。三、转座重组有些基因可以从一个位置移动到另一位置.可移动DNA序列包括：插入序列、转座子由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。（一）插入序列(insertionsequences，IS)转座典型插入序列：750-1500bpDNA片段包括：两个分离的反向重复（IR)序列;IR侧翼有短的正向重复序列;及一个转座酶编码基因.保守性转座：插入序列从原位迁至新位.复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制本迁至新位，另一个保留在原位.（二）转座子(transposons)转座可从一个染色体位点转移至另一位点的分散的重复序列，即一段可以发生转座的DNA。组成：侧翼为两个分离的反向重复序列；转座酶基因；抗生素抗性等有用的基因。第二节重组DNA技术基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为克隆）和行使正常功能（称之为表达），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝（copy）的集合。完整DNA克隆过程包括：①目的基因获取；②基因载体选择、构建；③目的基因与载体拼接；④重组DNA分子导入受体细胞；⑤筛选重组体⑥目的基因的表达。重组DNA技术（recombinantDNA）又称基因克隆（genecloning）（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶ⅠTaqDNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)定义识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGGTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口BamHⅠGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGG粘端切口异源同功酶，同裂酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶酶不同、识别序列不同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA•酶不同、识别序列相同，产生相同的粘性末端，称为同功异源酶。•酶不同、识别序列不同，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。（二）DNA聚合酶1.DNApolI：2.klenow片段：3.TaqDNApolPCR反应（三）DNAligaseDNA相邻的5’-P和3’-OH之间形成磷酸二酯键，切口封合或片段连接。1、T4DNAligase：催化相同黏性末端或平头末端的DNA分子的连接。2、大肠杆菌DNAligase:催化相同黏性末端的连接.二、基因工程的载体定义vector为携带外源DNA进入宿主细胞（无性繁殖或表达）的工具（DNA分子）。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准：能在宿主细胞中自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。作为表达载体，具有与宿主细胞相适应的调控元件：启动子，增强子等。（一）质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。质粒感染细菌后，会赋予宿主细胞一些遗传性状（如对青霉素或重金属的抗性)可作为筛选转化子细菌的根据。pBR322质粒(4361bp):主要包括：①限制性内切酶位点（插入外源基因）；②含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。③含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。4361bpM13噬菌体：M13mp系列pUC系列pUC质粒:加入E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω片段.单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。（三）目的基因：感兴趣的基因或DNA序列。目的基因，又称目的DNAcDNA基因组DNA外源DNA（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接同一限制酶的酶切:重组子、载体自连、目的基因自连不同限制酶的酶切：重组子目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录同一限制酶的酶切：两个不同限制酶的酶切：使目的DNA按正确的方向插入受体菌条件安全宿主菌，由大肠杆菌K12改造，在人的肠道几乎不能存活。限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式转化(质粒DNA分子导入细菌的过程）转染(噬菌体、病毒携带DNA分子导入宿主细胞的过程)（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等四环素抗性基因（Tetr）失活(插入失活法)抗药性标记选择α互补的检测α片段ω片段α片段ω片段原位杂交重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体扩增或表达重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交以质粒为载体的DNA克隆过程扩增或表达1克隆基因在大肠杆菌中表达2克隆基因在哺乳动物细胞中表达（六）克隆基因的表达思考题：1．自然界常见基因转移及重组现象有哪些？2．DNA克隆技术基本步骤？3．常用的工具酶切割方式有几种？4．外源DNA和载体DNA连接方式的区别？5．常见的重组体的筛选方式分类？插入失活和阿尔法互补原理？6．基本概念：同源重组、转座子、DNA克隆、限制性核酸内切酶、粘性末端、钝性末端、配伍末端、基因组DNA文库、cDNA文库、基因诊断、基因治疗