固相萃取

1固相萃取技术(SolidPhaseExtraction)•SPE的发展•SPE原理•SPE实用技术•SPE方法的建立和优化2静置1minSPE的发展发展历程•1971年，Broich等人从尿中提取滥用药物时首次使用液-固萃取(LiquidSolidExtraction)一词。•1979年，StOnge等首次定义固相萃取（Solid-PhaseExtraction）。•1983年，以Waters公司Sep-Pak系列为代表的各类商品化小柱进入市场，使固相萃取法有了长足的进步。3分析物干扰物柱预处理样品添加柱洗涤分析物洗脱SPE柱及配套装置（1）固相萃取附件•自然淋洗（简易支架）•加压（注射器）•加负压（真空装置）4SPE柱及配套装置（2）96孔板•高通量的SPE产品，每孔含少量吸附剂（10-100mg），样品载量约2ml/孔。•主要用于生物，医药等行业小量的多样品的净化处理。SPE柱及配套装置（3）自动化固相萃取装置SPE方法的优点•高样品回收率和良好的重现性•萃取过程简单快速，易于多样品平行操作•样品更干净•易于自动化，提高分析效率•降低溶剂的消耗5萃取过程连续萃取，每萃取一次需要的柱长称为一个塔板高度，一个固相萃取柱的萃取次数为5-20次SPE概念及基本原理•概念：固相萃取法是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理，使液体样品通过一吸附剂，保留其中某一组分，再选用适当溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。SPE概念及基本原理•目的：¾从试样中除去对以后的分析有干扰物质；¾富集痕量组分，提高分析灵敏度；¾变换试样溶剂，使之与分析方法想匹配；¾…….6SPE概念及基本原理SPE基本原理¾原理与HPLC法类似，区别如下：•SPE柱的填料粒径（40µm）比HPLC（3~10µm）大；•SPE柱是一次性使用。•SPE组成分分离，HPLC单组分。原理•溶质、溶剂分子竞争吸附（溶质、溶剂分子与吸附剂的关系）流动相体积固定相体积容量因子吸附系数＝量平衡时流动相中组分质量平衡时固定相中组分质＝度平衡时流动相中组分浓度平衡时固定相中组分浓VcVakqpkcaK××===1分子间相互作用：X=X斥+X引•X=X定+X诱+X色+X氢•Ｘ斥：排斥力位能场；•Ｘ定：定向力位能场；•Ｘ诱：诱导力位能场；•Ｘ色：色散力位能场；•Ｘ氢：氢键力位能场。7（1）、定向能（Ｘ定）•产生－偶极矩如果分子中具有电负性不同的原子时，则有可能产生正负电荷中心不相重合的现象，所带电荷与正负电荷中心间距离的乘积即为偶极矩。•μ1、μ2分别为两分子的偶极矩，•K:Boltzmann常数，•Ｔ:绝对温度，•r:两分子之间的距离。•z:在溶液中，每个溶质分子（Ａ）被z个溶剂分子有效包围ZkTrXBA62232μμ−=0.741,2,3-三甲苯0.371,2,4-三甲苯01,3,5-三甲苯偶极矩8（2）、诱导能（Ｘ诱）•产生－诱导偶极矩•具有永久偶极矩的性分子对邻近分子会产生诱导作用，产生诱导偶极矩。被诱导的分子可以是极性的，也可以是非极性的。•μ：永久偶极矩•α：极化率（偶极矩的电场力作用下，分子中电子云对分子骨架本身变形的程度）•r:两分子之间的距离62121rXAμα−=→62212rXBμα−=→62221rXBAμαμα+−=诱ZaarXAA)(1226溶剂溶剂诱μμ+−=80.8℃环已烷80.1℃苯沸点化合物9（3）、色散能（X色）•产生－非极性分子之间的作用能。•非极性分子的偶极矩虽然等于零，但是电子在围绕分子骨架运动的过程中，正负电荷中心的瞬间位置是不同的，因而形成同步电场，使邻近分子极化。极化后的分子又反过来加剧瞬间偶极矩变化的幅度，从而产生分子间的作用能。这种通过分子中电子摄动产生的作用能，被称为色散能。它与温度无关。•I：分子电离能。它反映了分子对外层电子的制约能力。212121623IIIIrX+−=αα色ZIIIIrXAAA溶剂溶剂溶剂色+−=αα623（4）、氢键作用能（Ｘ氢）•直接与电负性强的原子Ｘ（如F,O,N等）联接的氢原子，由于负电荷集中在X-H键的Ｘ原子上，氢原子的核又无内层电子的屏蔽，故当其与另一电负性强的原子Ｙ接近时可产生强烈的相互作用。这个作用力产生的力场就称之为氢键位能场。10醇、酸化合物－烷烃硝基苯酚、羟基苯酚的三个异构体二甲酚异构体不同溶质（药物）的吸附效率CLCLCLCLCLCLCH3OPSONO2CH3O净化——淋出曲线•表52g活性碳/Cilete545（1：4）柱淋洗曲线淋洗体积ml淋出百分率%r-666甲基对硫磷0~5－－5~10－－10~1551－15~2047－20~252－25~300.5230~35－1935~40－2540~45－845~50－550~55－355~60－111•假设固定相和流动相体积相等，35,1722146==）（药物，（药物，）ClCHHCkk不同溶剂对柱容量的影响溶剂ε0溶剂ε0溶剂ε0正戊烷0.00乙醚0.38乙腈0.65异辛烷0.01氯仿0.40异丙醇、正丙醇0.82环己烷0.04二氯甲烷0.42乙醇0.88四氯化碳0.18四氢呋喃0.45甲醇0.95二甲苯0.26丙酮0.56乙二醇1.11甲苯0.29乙酸甲酯0.60乙酸大苯0.32苯胺0.62氧化铝的溶剂洗脱能力顺序混合溶剂的洗脱强度12•溶剂强度计算公式：•S＇=FaSa+FbSb+….+FcSc•其中：•F—溶剂在混合溶剂中的体积分数•S—溶剂强度参数。不同溶剂的洗脱体积()33/5171)1()1()1()1()1()1(11212121221121)()()()()()(=++=++==++=+++×=+kkVVVVkVkVVVkVoVktokUtUULtkUURROOooRRROoORO＝＝＝（柱长）＝保留体积流动相移动速度（死时间）流动相移动速度谱带移动速度保留时间流动相移动速度谱带移动速度不同吸附剂对干扰物（叶绿素）的吸附13常用的固相萃取填料及性质目前常见的SPE填料类型：（一）吸附型填料（二）键合硅胶（三）高分子聚合物（四）混合型及专用柱系列常见的固相萃取柱SPE柱键合硅胶为基质高分子聚合物为基质吸附型材料为基质混合型材料为基质专用SPE柱ODS,C8,CN,NH2,COOH,Silica,PSA,PRS,SCX,SAX,DiolPEP,HXN,PS,PAX,PCXFlorisil,PestiCarb,Alumina-N,Alumina-A,Alumina-B,C8/SCXPestiCarb/NH2SUL-5,HXN（一）吸附剂（1）弗罗里硅土（Florisil）硫酸镁和硅酸钠作用，沉淀，干燥特点：表面积大，适合于对脂肪含量高的样本进行净化。活性标准：LA:mg月桂酸吸附量/g75-116mg(110mg)处理：水洗除去Na2SO4，650oC加热5h活化处理：650oC加热1-3h，保存于130oC脱活：3-5％水14参考文献•李本昌陶传江，谷物蔬菜水果中70种农药在Florisil柱中淋洗效率，农药科学与管理，1995，4，10-12溴氰菊酯在油料中的残留净化方法10mL石油醚予淋用少量石油醚将浓缩液定量转入层析柱中用石油醚淋洗杂质用石油醚/乙醚（80：20）淋洗溴氰菊酯预淋溶液（1）极性，（2）惰性上样溶剂；惰性弗罗里硅土无无水水硫硫酸酸钠钠（2）氧化铝活化处理：130oC加热4h以上，酸性、中性、碱性氧化铝对脂肪、腊质也具有较好的吸附作用，同时对色素也有一定的吸附效果。活度：加水脱活机理：通过吸附杂质达到净化的目的，因此在操作过程中从上样即开始收集。15•酸性氧化铝（180-200目）•每g酸性氧化铝吸附5mg叶绿素22mg类胡萝卜素17mg油脂或蜡质•碱性氧化铝：用于兽药分析•中性氧化铝中性氧化铝萃取柱pH=7.5；强极性吸附剂。表面呈中性，容易保留杂环类（含氮，磷，硫基），芳香烃和有机胺等富电化合物。经过特殊去活处理，以保证样品的前处理。应用1.用于苏丹红和孔雀石绿的样品前处理。2.维生素,抗菌素,芳香油,酶,糖苷,激素（3）硅胶硅胶柱淋洗剂依次分别为①正己烷/甲苯（6∶4）有机氯农药②甲苯拟除虫菊酯农药和极性偏低的有机磷农药③甲苯/丙硐（95∶5）中等极性和极性稍④甲苯/丙硐（80∶20）强的农药⑤丙硐，甲胺磷等极性强的农药16例1：多杀菌素及其代谢物的残留分析区别区别消解动态及昀终残留棉田土壤棉田土壤棉叶棉叶棉籽棉籽提取提取液液萃取液液萃取（酸）（酸）液液萃取液液萃取（碱）（碱）过过无水无水NaNa22SOSO44漏斗漏斗色谱分析色谱分析11223344SilicaSilica小柱小柱(Waters500mg)(Waters500mg)净化净化17多杀菌素残留分析步骤不同pH值条件下Spinosad在水相和有机相中的分配比例\\\\60%76％100％100％100％100％水相100％100％100％100％40％24%\\\\有机相12.511.510.59.58.53.02.72.11.91.4pH值调酸阶段调酸阶段调碱阶段调碱阶段18Minutes02468101214-0.75-0.50-0.250.000.25-0.75-0.50-0.250.000.252.6466861:250nm,8nm7.5ngRetentionTimeAreaMinutes024681012142.6100.00Minutes0246810121416183.334.524.254.764.810.72标准品棉籽空白色谱图土壤空白色谱图棉叶空白色谱图Minutes0246810121416182022248.79.913.515.7色谱固定相极性先于非极性非极性先于极性出峰次序极性大极性大流动相极性小极性小固定相反相正相（4）碳吸附剂活性碳（是非极性吸附剂），•对色素的吸附非常理想，吸附30mg/g叶绿素。•脂肪、腊质吸附不强•与弗罗里硅土、氧化铝混用效果较好。问题：•不可逆吸附•使用时需加助滤剂19石墨化碳黑•GCB是由炭黑作为原料，在惰性气体(通常为氩气)的保护下加热到2700-3000℃以上，除去炭黑中的残留有机物，提高碳的含量，同时破坏炭黑内部和表面的大孔隙，生成光滑、均一、无孔的表面。这时的炭黑经高温处理后，表面具有规则的石墨三维晶型结构，微观结构是正六边形。因此将其称为GCB。特点•固相萃取用的GCB的吸附表面积为100m2/g，颗粒分布在120-400mu。由于表面具有特殊的六边形结构，使GCB对具有六边形结构的化合物有很强的选择性吸附，因此GCB与其它吸附剂昀大的区别是[32,42]：它是一种非特异性吸附剂，即对化合物的吸附和解吸附作用与化合物的极性没有特定的关系，而与结构存在紧密的联系；此外，在GCB表面存在一些具有苯并呋喃环结构。•GCB属于一种反相固相萃取，目前这种填料的固相萃取柱广泛用于蔬菜样品中农药多残留净化方法。它不会对农药产生永久性吸附；对农药表现较广的吸附谱；可以有效的去除蔬菜中的色素、降低基质效应、减少对气化室、柱子的污染。•水中农药的富集20色谱固定相极性先于非极性非极性先于极性出峰次序极性大极性大流动相极性小极性小固定相反相正相（二）键合硅胶•在SPE中昀常用的吸附剂是硅胶或键合相的硅胶即在硅胶表面的硅醇基团上键合不同的有机基团；•物理性质：粒径（e.g.45µm)、孔径（e.g.60A）、表面积（480m2/g)、键合量易控制;机械强度高;化学性质稳定；（一）键合硅胶21（一）键合硅胶（一）键合硅胶优点：•种类较多（较多选择）；•单分子层键合—吸附/解析速度快代表产品：•C18,C18-N,C8,CN,NH2,COOH,Silica,PSA,PRS,SCX,SAX,Diol.C18SPE柱•用于水相中药物的富集•用于蔬菜，水果中富含水分中农药的富集22例2：阿维菌素在梨中的残留分析•称取5g样品于50ml离心管加10ml乙腈用组织均质机捣碎(10000转/分均质1分钟)，离心1min（3500转/分），移取上