实时荧光定量PCR介绍

August25,2020实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司实时荧光定量PCR介绍28/25/2020•主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例实时荧光定量PCR介绍38/25/2020•RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍48/25/2020•RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析GMO定量检测差异显示结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认mRNA表达量分析病毒及病原菌检测物种鉴定基因分型绝对定量相对定量实时荧光定量PCR介绍58/25/2020•RealTimePCR的原理激发光发射光使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。RealTimePCRCt值实时荧光定量PCR介绍68/25/2020•RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍78/25/2020•TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI荧光染料嵌合法荧光探针法RealTimePCR的检测方法实时荧光定量PCR介绍88/25/2020•荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI实时荧光定量PCR介绍98/25/2020•Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer热变性FFFF实时荧光定量PCR介绍108/25/2020•TaqMan法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5’端标记一个报告基团（Reporter），3’端标记一个淬灭基团（Quencher）。RQ实时荧光定量PCR介绍118/25/2020•RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性退火延伸TaqManProbe法原理示意图实时荧光定量PCR介绍128/25/2020•One-StepRT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高Probe法Probe合成费用高SYBRGreenI法与Probe法比较常用于mRNA表达量分析等SYBRGreenI法简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌检测实时荧光定量PCR介绍138/25/2020•主要内容2RealTimePCR实验方法反转录反应RealTimePCR反应实时荧光定量PCR介绍148/25/2020•RTPrimer的选择RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer实时荧光定量PCR介绍158/25/2020•目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以内适用，RT效率较高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不适用于复数基因的检出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。RTPrimer的选择实时荧光定量PCR介绍168/25/2020•RealTimePCR引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物实时荧光定量PCR介绍178/25/2020•两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)★GC含量Primer长度80-150bp(尽量限制在300bp以内)★扩增片段大小★17-25base使用BLAST检索，确认引物特异性★★★特异性△引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列△引物3’末端避免2base以上的互补序列★★★互补性3’末端序列△整体上碱基不能过偏△个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)△避免T/C连续，A/G连续★序列★△3’末端避免GCrich或ATrich△3’末端碱基最好为G或C△3’末端碱基尽量避免为T尽量在Exonjunction上设计引物，限制基因组DNA扩增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物设计原则实时荧光定量PCR介绍188/25/2020•探针的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe长度探针5’末端的第一个碱基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相对较高的区域设计△整体上碱基不能过偏△个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)；避免T/C连续，A/C连续★序列Probe内部或Probe与两条引物之间避免3base以上的互补序列★★★互补性BLAST检索确认Probe特异性★★★特异性RealTimePCR用TaqMan探针设计原则RealTimePCR探针设计原则实时荧光定量PCR介绍198/25/2020•线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认PCR扩增效率（E）：0.8-1.235Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。NoTemplateControl确认30Cycles内无引物二聚体产生。相关系数（r2）：大于0.98反应性能确认实时荧光定量PCR介绍208/25/2020•主要内容3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量PCR介绍218/25/2020•标准曲线制作扩增曲线标准曲线•标准品梯度的选择：5～6个梯度•标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10105104103102101100105104103102101100实时荧光定量PCR介绍228/25/2020•标准品的种类基因组DNA质粒TotalRNA&cDNA体外转录RNADNA样品定量标准品RNA样品定量标准品实时荧光定量PCR介绍238/25/2020•质粒标准品构建流程基因组DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因质粒质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。实时荧光定量PCR介绍248/25/2020•体外转录RNA标准品构建流程RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。T7RNApolymerase体外转录RNATotalRNAPCRcDNARTT7PromoterTTTT•••TPCR产物目的基因目的基因目的基因AAAA•••AAAAA•••A实时荧光定量PCR介绍258/25/2020•理想的标准品扩增曲线基线平整NegativeControl为水平线指数区较明显，陡度大平台区汇于一起线性范围宽实时荧光定量PCR介绍268/25/2020•理想的标准曲线相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。扩增效率相关系数扩增效率（E）计算方法标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时E=10-1/a-1标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10)E=10-a-1实时荧光定量PCR介绍278/25/2020•RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量PCR介绍288/25/2020•融解曲线分析Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。SYBRGreenI法进行检出时，要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。实时荧光定量PCR介绍298/25/2020•特异性产物非特异产物引物二聚体对PCR产物特异性进行分析融解曲线分析实时荧光定量PCR介绍308/25/2020•3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法RealTimePCR解析方法实时荧光定量PCR介绍318/25/2020•绝对定量解析方法提取样品引物设计标准品制备RealTimePCR反应数据分析流程实时荧光定量PCR介绍328/25/2020•绝对定量解析方法通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。105104103101扩增曲线图标准曲线图检测样品检测样品102实时荧光定量PCR介绍338/25/2020•相对定量解析方法以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同进行相对表达量分析必要性实际上目的基因表达量分析实时荧光定量PCR介绍348/25/2020•相对定量解析方法管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、β-actin等。筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选实时荧光定量PCR介绍358/25/2020•主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例◇对SARS病毒基因进行定量分析绝对定量相对定量◇分析小鼠PAH基因在不同组织中的表达量变化实时荧光定量PCR介绍368/25/2020•绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量检测方法TaqMan®probe法检测样品3个从SARS样品中提取的TotalRNA目的基因SARS病毒RNA内参SARSInternalControlRNA标准品SARSControlRNA试剂OneStepPrimeScript®RT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）仪器SmartCyclerⅡ实时荧光定量PCR介绍378/25/2020•SYN247F02SYN247R03SYN247F01SYN247R02SYN247R01SYN247F01BamHⅠHindⅢpBluescriptIISK(+)VectorT7PromoterBamHⅠHindⅢSacⅠsiteSARSControlRNA构建绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍388/25/2020•纯化的SARSControlRNAOD值测定结果体外转录的SARSControlRNA电泳照片M1M2M1:-HindⅢdigestM2:DL2,000MarkerDNaseI处理前DNaseI处理后绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍398/25/2020•DNABNITMSARAs2AdaptorRSacⅠsiteBamHⅠsiteBNITMSARS1AdaptorFT7PromoterSARSInternalControlRNA的构建AApBluescriptIISK(+)Vector绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量实时