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《MolecularVirology》华中师范大学生科院分子病毒学目录第一章概论第二章病毒的形态结构第三章病毒吸附宿主及内化过程第四章病毒的基因组复制第五章病毒基因的表达第六章病毒装配和释放第七章病毒感染与机体抗病毒免疫第八章病毒感染的病理与治疗Basicprocessofviralassembleandrelease2-capsidformation3-genomepackagedintocapsid4-acqureenvelope1-structuralunitformation6-maturation5-release病毒的组装Assembly1.装配：在宿主内，合成一个完整的病毒粒子需要的各个组分按照一定一定方式进行组装形成一个新的病毒粒子的过程；2.装配过程中，结构蛋白首先形成一个结构单元（structuralunit）；然后多个结构单元再组装成不成熟的前衣壳，经过一定修饰，形成成熟的衣壳。3.装配位置因病毒不同而异，主要取决于病毒在胞内复制位点和释放机制:胞质中装配：picornaviruses,poxviruses&reoviruses核中装配：adenoviruses,polyomaviruses&parvovirusesit胞膜位置装配：HIV病毒的自组装和辅助组装Self-AssemblyandAssistedAssemblyVP1pentamersinSV401---有的病毒蛋白一级结构序列含有足够的自组装信息。比如，VP1在E-coli表达,分离出来的VP1就是五聚体，在体外就可组成类-衣壳的结构2----尽管对病毒结构蛋而言，自组装是基本机制，但还需要病毒的或细胞的其他组分参与组装，起辅助作用。参与病毒组装的辅助成分病毒成分：-基因组RNA（作为装配时的支架（scaffold）---ssRNAvirusesandRetrovirusassembly).或与结构蛋白互作）----.细胞成分-胞膜结构蛋白与细胞膜发生关联（association），对某些蛋白衣壳装配是必需的-CellularandViralproteins参与病毒组装的辅助成分-CellularandViralproteins参与病毒组装的细胞辅助成分分子伴侣-CellularandViralproteins参与病毒组装的病毒辅助成分分子伴侣支架蛋白病毒支架蛋白ScaffoldingProtein•是病毒装配必须成分•支架蛋白：参与核衣壳或衣壳的装配，但后来又被移除，所以这类蛋白称为支架蛋白。举例-VP22a,HSV-1-L152/55-kDa,AdenovirusHerpesvirus1结构单元（structuralunit)的组装-机制-----由单一蛋白（individualproteins）------或长肽多聚蛋白（polyprotein）组装-----由细胞或病毒的分子伴侣（ViralChaperoneorCellularChaperone）协助第一步蛋白衣壳的装配SV40病毒衣壳五聚体的组装---来自单个蛋白表达组装腺病毒II型衣壳五聚体的组装---来自单个蛋白脊髓灰质炎病毒衣壳结构单元组装---来自于长肽寡聚蛋白---腺病毒II型衣壳六聚体的组装---分子伴侣辅助第二步：形成衣壳或核衣壳BacteriophageT4–鞘机基盘的组装头部组装尾丝组装BacteriophageT4–progressivelymorecomplexstructuresareformedinastepwisemechanism对许多病毒而言，衣壳结构中间体很难分离或包装（packaging）:把基因组装进装配好的或正在装配中的粒子中要求：基因组上要有特定的识别位点(PackagingSignals),以区别与宿主核酸成分第三步：包装基因组和其它病毒成分-Ψsequenceatthe5´endofRetrovirusisthemajorpackagingsignal.反转录病毒RNA基因组上的包装信号螺旋对称杆状衣壳的装配（helicalcapsids）以TMV为例：衣壳的装配围绕基因组进行1.衣壳蛋白首先形成一个盘状结构,由17个亚单位（subunits，capsomers，衣壳粒）组成2.合成好的基因组RNA被捕获到盘状结构的中心，挂在盘子的“内壁”上（基因组内部的一个位点与内壁结合）；3.以盘状结构为中心，向两个方向延伸，堆积结构单元，延长杆状结构4.延长过程中，RNA基因组从上下两个方向分别不断被拉伸进入螺旋结构的内壁53盘状结构（起始结构）合成好的基因组RNA上下衣壳向两个方向延伸基因组的两端也贴着衣壳内壁，向两个方向延伸，嵌合在衣壳内壁中特定序列TMVassembly二十面体球状衣壳和基因组的组装外壳先装配，基因组再插入1结构单元（capsomersubunits）围绕着支架蛋白（scaffoldingprotein）进行初级组装成前衣壳（procapsid）2支架蛋白被从衣壳中移除（再利用），形成一个中空衣壳。3基因组塞入中空衣壳。这个过程需要能量和衣壳一定的构象的变化。某些病毒蛋白（核酸酶活性）可以识别基因组的包装信号序列，并与之结合形成复合体；再与空衣壳的门户蛋白发生相互作用，把基因组拉伸进入衣壳；当一倍长度的基因组拉伸进入衣壳时，在复合体中核酸酶切割下其余部分；门户蛋白被帽蛋白取代，核衣壳组装完毕•Fig.p72前衣壳到变成成熟的衣壳需要一定病毒编码的蛋白水解酶（成熟蛋白酶）的参与，将一些前衣壳中的蛋白进行酶切，会导致衣壳结构发生微小的改变或稳定性发生微弱改变，这个过程中伴随着基因组的进入。支架蛋白门户蛋白单纯疱疹病毒DNA基因组的包装长独特区短独特区重复序列α中含有包装信号序列（pac1,pac2）,重复序列α在基因组上由多个拷贝（短独特区US只有一个拷贝）单纯疱疹病毒基因组复制是形成多拷贝的基因组头尾相连的多连体DNA基因组包装信号（pac1,pac2）位于基因组末端重复序列α中。两侧还有正向重复序列（DR）是切割位点Step1-2是基因组被包装的过程启动：先有几个病毒蛋白（UL15，UL32,UL28，末端酶，或称包装蛋白，具有核酸切割活性）结合在基因组上的包装信号序列位置形成一个复合体，与衣壳上的门户蛋白portal发生相互作用，接下来，基因组的一个正向重复序列处（DR）发生第一次切割，由复合体中的包装蛋白切下。基因组被拉入衣壳中；Step3是在多连体基因组上一个全基因组位置被拖至入衣壳中后，由复合体中的包装蛋白在另一个正向重复序列处（DR）进行第二次切割。Step4是由病毒编码的帽蛋白塞住衣壳出口。单纯疱疹病毒DNA基因组的包装病毒其它组分（酶或蛋白）进入衣壳1:有些病毒蛋白本身是结构蛋白，同时参与病毒在宿主内的复制过程。Someoftheseproteinsarealsostructuralproteinsofthevirion-单纯疱疹病毒的VP16protein：amajorcomponentoftheviriontegumentandtheactivatoroftranscriptionofviralimmediate-earlygenes.2:它们包装进入衣壳需要特定机制：（-）RNA病毒的转录酶RNA-dependentRNApolymerase必须以非共价键与基因组或结构蛋白相互作用被包装进去，进入宿主后才可独立发挥作用(-)strandRNAviruses1.有的病毒（如疱疹病毒）是在细胞核中进行装配，所以它们出核膜时就会获得一层包膜；2.其它包膜病毒衣壳装配可以发生在胞质中，有的如HIV发生在包膜上，所以可以从内质网膜或细胞膜上获得包膜结构.注意：这些脂膜上必须有病毒编码的糖蛋白—后期表达蛋白，在高尔基体上修饰后，随着液泡系运输到膜系中第四步获得包膜跨膜蛋白是在粗面内质网上合成：当在核糖体上合成出来就插入到内质网中，在内内质网中糖基化。转移到高尔基体进行进一步修饰和折叠，然后转运到细胞膜上病毒包膜中的糖蛋白的形成和转运HSV：Herpesviruses在核内包装冠状病毒E1在内质网上包装•机制一:大多数包膜病毒，包装和获得衣壳是在时空上是分开的过程e.g.Influenzavirus/VSV第四步获得包膜•机制二：反转录病毒，装配和获得衣壳及出芽在时空上是同时的（coincident）.第四步获得包膜反转录病毒装配和包膜的获得及出芽释放衣壳囊膜基因组膜上的跨膜糖蛋白除植物病毒要设法突破植物细胞壁的障碍外，其它病毒从宿主中释放一般采用的机制有：------裂解细胞：(mostnon-envelopedviruses),宿主细胞完全破裂，病毒出来（噬菌体）---嗜菌斑细胞空斑-----出芽：(Envelopedviruses）---病毒粒子释放时在细胞膜胞质侧向外顶出形成芽状（细胞膜包裹着病毒粒子），离开细胞时就可以获得相应的囊膜，------运输泡:病毒在释放前先进入一个胞外运输泡（intracellularvesicle），再通过细胞运输泡系统运出到胞外。第五步病毒释放空斑形成机制一裂解细胞释放第五步病毒释放包膜病毒出芽释放-----‘pull’-or‘push’-机制第五步病毒释放出芽点：病毒糖蛋白插入包膜，产生拖的力量，把包膜拖出一个芽结构内部病毒结构蛋白粘附与出芽点，产生一个推的力量机制二反转录病毒出芽释放衣壳囊膜基因组膜上的跨膜糖蛋白包膜病毒在内膜系统上出芽第五步病毒释放在核膜，内质网膜上，高尔基体膜上插入病毒糖蛋白，病毒出芽获得包膜结构，进入运输系统（膜泡运输）优点：避开对宿主细胞胞质膜的糖蛋白修饰，减少免疫系统监视内膜没有细胞骨架附着，出芽更方便具有独特的脂成分第五步病毒释放裸病毒,SV40机制三：病毒进入转运小泡-transportvesicles，与膜融合释放出来ReleaseofEnvelopedVirusesHSV：Herpesviruses在核内包装，穿过核膜时的出芽（在核膜上获得包膜），在内质网上和高尔基体形成运输泡（A)，还可能是从核膜上获得包膜又被溶解，经过高尔基体时获得包膜，被运输泡运出去。流感病毒释放时包膜上的神经氨酸酶的作用神经氨酸酶（NA蛋白）具有酶的活性，作为唾液酸糖苷酶，清除病毒颗粒表面糖蛋白上及感染细胞表面的唾液酸，防止病毒粒子的聚集，以及有助于病毒粒子的释放NA与HA（血凝素）是流感病毒亚型分型的重要指标NA是一种糖苷外切酶,可以从糖苷键上除去唾液酸残基流感病毒释放时，新病毒颗粒移向细胞表面，仍通过血凝素-唾液酸键进行结合。唾液酸神经氨酸酶的主要作用是催化裂解存在于唾液酸末端、N-乙酰基神经氨酸及相邻糖基间的酮苷连接桥，从而促进病毒在呼吸道的传播,因为该键的断裂使病毒从感染的细胞中释出，并阻止病毒从宿主细胞释出后的聚集。神经氨酸酶还可通过裂解呼吸道黏膜中的唾液酸,灭活呼吸道黏液的黏液素(能抑制血凝素活性),使呼吸道黏液的活性减除,阻止病毒灭活,有助于病毒颗粒移向靶细胞,防止游离的病毒颗粒凝集在一起,促进病毒渗入呼吸道上皮细胞及其在呼吸系统的扩散。通过这种方式,感染在体内扩散。神经氨酸酶对流感病毒致病性也有作用,它能改变另一种表面糖蛋白血凝素的糖基部分,从而增强一些菌株的毒力。药物作用靶标---寻找NA的抑制剂，通过阻断NA,可使病毒颗粒聚集在一起,黏着于细胞表面,不能感染其他细胞。由于NA的活性可被特异性的抑制物或抗体所抑制,从而使NA丧失吸附融合复制装配和出芽等功能,因此根据这一特点,国内外研究出许多抗流感药物第六步病毒成熟包装好的病毒颗粒如果没有感染性，称为未成熟的病毒体若变成有感染力的病毒毒体，则需要蛋白水解处理蛋白水解过程涉及到病毒蛋白水解酶的作用病毒粒子成熟Maturation1.成熟过程常常涉及病毒粒子结构的改变（对前衣壳进行特定位点的切割）或构象的变化.2.这种变化可以导致衣壳发生一些可以检测到的变化：比如成熟前后，抗原性（antigenicity）或核蛋白与基因组的聚集（condensation）性质会发生变化；3.病毒成熟