细菌药敏试验及其耐药表型检测

细菌药物敏感试验及其耐药表型检测沙湾县人民医院检验科张伟荣抗菌药物敏感试验测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验（AntimicrobialSusceptibilityTest），简称药敏试验（AST）。药敏试验的意义预测抗菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应用；发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。药敏试验MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是18～24小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。敏感性分类(CLSI的定义)敏感（Susceptible）用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC5倍以上。耐药（Resistance）用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度敏感性分类（2）中介(Intermediate)MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株药物生理浓集部位有效(尿-FQ)加大用药剂量可能有效药敏试验的方法学半定量…纸片扩散法(抑菌圈直径)MIC法：稀释法(肉汤、琼脂)自动化仪法抗生素连续梯度法(Etest)流式细胞仪将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。纸片扩散法（Kirby-Bauer法）纸片扩散法1.水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，做成琼脂厚度4mm，直径90mm的平板；2.挑取孵育16～24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。纸片扩散法3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；4.然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度；5.最后沿平板内缘涂抹1周；6.平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm。纸片扩散法7.35℃孵育16～24小时量取抑菌圈直径；8.根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。12纸片扩散法－影响因素MIC接种菌量细菌生长率抗生素含量、扩散性平皿厚度温度，预孵育时间13纸片扩散法－标准化CLSI：美国实验室标准化委员会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)每年修订更改包括质控新药的判定标准特殊耐药性的检测14CLSI的法规规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控；规定常规测试报告的抗生素；不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。15常规测试并报告的药物分组(1)肠杆菌科绿脓和非肠杆菌科一级氨苄西林头孢他啶，庆大霉素头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林二级阿米卡星阿米卡星氨苄西林/舒巴坦头孢吡肟，头孢哌酮阿莫西林/克拉维酸氨曲南头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南头孢噻肟，头孢曲松替卡西林/克拉维酸环丙沙星，亚胺培南妥布霉素，复方磺胺替卡西林，哌拉西林三级氨曲南，头孢他啶头孢曲松卡那霉素，奈替米星氯霉素，奈替米星妥布霉素四环素，氯霉素16常规测试并报告的药物分组(2)葡萄球菌肠球菌一级苯唑西林，青霉素青霉素，氨苄西林二级红霉素类万古霉素克林霉素，万古霉素三级氯霉素庆大霉素17常规测试并报告的药物分组(3)流感嗜血杆菌肺炎链球菌一级氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素复方磺胺复方磺胺二级头孢呋肟，头孢噻肟氧氟沙星，四环素头孢他啶，氯霉素万古霉素三级阿奇霉素，头孢克罗氯霉素，利福平环丙沙星，亚胺培南利福平，四环素18预报用药(一)测试药菌名推测其他药物的敏感性苯唑西林葡萄球菌所有β-内酰胺类四环素所有（除葡多西环素，米诺环素萄球菌和不动杆菌〕红霉素G＋球菌罗红霉素，克拉霉素，阿奇霉素克林霉素所有林可霉素2020/8/2619预报用药(二)测试药菌名推测其他药物的敏感性氨苄西林肠球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨苄西林，美洛西林替卡西林头孢噻吩肠杆菌科头孢拉定，头孢氨苄头孢克罗奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类万古霉素所有替考拉宁以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基者为肉汤稀释法。药敏试验-稀释法Etest法E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度；抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围；将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。2020/8/26wanghui-ART22Etest法细菌生长区Etest塑料条椭圆形细菌生长抑制区2561288016判读抑菌浓度（MICug/ml)Etest法菌液制备及接种均同纸片扩散法。90mm平板上可放E试验试条1～2条，140mm平板最多可放6条。孵育温度及时间同纸片扩散法。2020/8/2624Etest法优点连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好影响因素少，稳定性高操作简单，省时缺点：昂贵用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，分枝杆菌细菌耐药机制细菌耐药机制主要有四种：产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶Ⅳ的改变等；细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋白丢失；细菌主动外排系统的过度表达。在上述耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。Β-内酰胺酶β内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中；检测方法有微生物培养法、碘－淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。葡萄球菌属–青霉素方法敏感中介耐药MIC0.12g/ml-0.25g/ml纸片扩散法29mm-28mmCLSIM100-S20.Table2C.诱导β-内酰胺酶试验苯唑西林(诱导剂)-接种纯菌落于琼脂上(例如，BAP,MHA)；-贴ß-内酰胺类纸片(例如,苯唑西林,头孢西丁)；-孵育过夜；-测试抑菌圈周围的细菌；-如果β-内酰胺酶阳性,报告青霉素R。PosNeg超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制；ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）纸片法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL（筛选阳性）：•头孢泊肟≤17mm•头孢他啶≤22mm•头孢噻肟≤27mm•头孢曲松≤25mm•氨曲南≤27mm超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）纸片法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差≥5mm时，即可判断该菌产ESBL。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL：•头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC≥2g/mL•或头孢泊肟MIC≥8g/mL超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）稀释法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。AmpC酶的特征AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的Ⅰ型β内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。AmpC酶的检测方法头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法；除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、头孢西丁琼脂基础法等。碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的β-内酰胺酶，主要分布于β-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类β-内酰胺酶；另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类β-内酰胺酶。碳青霉烯酶A类酶B类酶D类酶染色体编码：SMENMCIMI质粒编码：KPCGES质粒编码OXA-23OXA-24OXA-51OXA-58OXA-55OXA-48OXA-50OXA-60OXA-62金属酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制剂抑制可以被EDTA抑制碳青霉烯酶表型检测方法-改良hodge试验ATCC25922，0.5麦氏，1:10稀释涂MH平板平皿中心贴10μg厄他培南或亚胺培南纸片10μl环挑取3～5个菌落从平板中心纸片边缘向平板边缘划线被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌环交汇处大肠埃希菌生长增强，即产碳青霉烯酶。改良hodge试验的结果判读金属酶表型检测方法：EDTA协同试验用0.5麦氏单位的待测菌悬液涂布MH平板。贴IMP(10μg)纸片．距其1cm处贴EDTA纸片（0.5mol/L4μl）。35℃过夜培养。亚胺培南抑菌圈在靠近加EDTA纸片侧明显扩大者为产金属酶菌株。亚胺培南EDTA10mm耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的β-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而导致对这些抗生素的耐药。耐甲氧西林葡萄球菌耐甲氧西林葡萄球菌的检测MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。凝固酶阴性葡萄球菌中苯唑西林MIC结果的报告策略*苯唑西林MIC(µg/ml)进行mecA或PBP2a或头孢西丁纸片扩散≤0.25≥4.00.5-2.0报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药阴性阳性报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药*检测无菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株克林霉素诱导耐药试验克林霉素诱导耐药葡萄球菌红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。*或其他大环内酯类机制耐药基因红霉素克林霉素核糖体修饰-药物不能结合于靶位ermRS*RR结构性泵-药物被泵出msrARSerm=erythromycinribosomemethylasemsrA=macrolidestreptograminresistance*需要诱导来显示耐药性红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制诱导性克林霉素耐药（erm介导）葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导（msr