蛋白质的研究方法与原理

.第十章蛋白质的研究方法与原理.第一节概述.蛋白质的分离纯化包括以下过程：1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;（盐析法或有机溶剂法）3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；4.蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。直接从生物组织中提纯蛋白——.制备过程中注意事项：要求自始至终保持在天然状态1.避免一切过激因素--如过酸或过碱，高温，重金属等的影响。2.通常都在低温条件下操作。3.尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高水平。.第二节蛋白质的分离与纯化技术.一、蛋白质沉淀与结晶.（一）盐析法概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。优点：操作简便对易变性的蛋白质有一定的保护作用，适用范围十分广泛。缺点：分辨能力差，纯化倍数低.（1）盐的种类对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力也愈强:PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CNS-K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+常用的中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。.硫酸铵（常用盐析剂）优点：盐析能力较强具有较高的溶解度较低的溶解度温度系数价格低廉不产生副作用。缺点：缓冲能力较差PH难控制.（2）PH和温度S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响:•PH=PI时，S。的数值极小•S。随温度增加而减低。盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。.（3）蛋白质浓度[Pr]较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开始析出，盐析界限比较宽。[Pr]较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析界限变窄。.1.基本原理（1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。（2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也促使Pr变得不稳定而聚集析出.常用的有机溶剂：乙醇和丙酮（二）有机溶剂沉淀法分辨力比盐析方法高，提纯效果好.（三）选择性沉淀法选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标蛋白质的分离方法。例如，将提取液加热至一定温度并维持一段时间，是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等。应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去的及欲提纯的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。.（四）蛋白质结晶蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有规则排列状态的固体，常用语分析研究其结构。蛋白质结晶是一个有序化过程，当蛋白质溶液达到过饱和状态，能够形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由运动的能量，不断地结合到形成的晶核上，长成适合于X线衍射分析的晶体。.二、离心技术分离蛋白质离心技术是利用物体告诉旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其它颗粒分离之目的。.三、层析技术分离纯化蛋白质最基本的特征：固定相流动相层析技术（chromatography）又称色谱技术，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时，这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最大的分离效果。.气相层析按两相状态来分液相层析吸附层析分配层析离子交换层析按层析机理来分凝胶排阻层析亲和层析柱层析按操作方式来分薄层层析纸层析层析技术的种类.（一）凝胶过滤层析又称分子筛或凝胶过滤（gelfiltration）原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。.离子交换层析法*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。.亲和层析法原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一分子可逆结合的特性。如，酶的活性部位能和底物\抑制剂\辅助因子专一性地结合,改变条件又能使这种结合解除.[酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结合蛋白与结合物之间]。这些被作用的对象物质称之为配基（ligand)。.高效液相层析法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。.四、电泳技术分离蛋白质电泳（electrophoresis）是指带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS–(十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂(Sodiumdodecylsulfate,SDS)Qu=（迁移率）6πrηu与Q、r有关若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGE中进行电泳，由于分子筛效应，u仅取决于分子的大小。因此SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。.这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的分子量范围：5％胶浓度时，适用于分子量6～200万的区间；10％胶浓度时，适用于分子量1.6～7万的区间；15％胶浓度时，适用于分子量1.2～4.5万的区间。.聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱.等电聚焦电泳——（isoelectricfocusing,IEF）是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度。pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等.Pr分子有一定的PI，它处在一个由阳极到阴极梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。.优点：1.有很高的分辨率；2.可以区分等电点只有0.01pH单位差异的蛋白质；3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。.双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳--PI第二向采用SDS一凝胶电泳--分子量由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。是蛋白质组学研究的核心技术。.双向PAGE.具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：①等电点（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白质；②分子质量很大的蛋白质，比如大于l00kDa的蛋白质就比实际的少了，而大于150kDa的蛋白质就几乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被观察到；③疏水性蛋白质。双向电泳技术缺点.高效毛细管电泳.1.毛细管区带电泳（CZE）毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳,这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带电粒子的迁移速度依赖物质的荷/质比差异。荷/质比越大，泳动越快。.2.毛细管凝胶电泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。.3.胶束电动毛细管色谱（Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC）缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。.4.毛细管等电聚焦电泳（Capillaryisoelectricfocusing，CIEF）是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；CIEF是在毛细管内充有两性电解质，当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；此法可用于测定蛋白质的等电点、纯度鉴定、不同变异体的分析等。.5.毛细管等速电泳（Capillaryisotachophoresis，CITP）将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。.6.亲和毛细管电泳（affinitycapillaryelectrophoresis,ACE）是毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。.7.毛细管电动色谱（Capillaryelectrokineticchromatography，CEC）在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。.第三节蛋白质含量的测定方法.测定蛋白质含量的方法较多基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物学活性建立起来的。.目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法(Biuret法)，Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法(Bradford法).其中Bradford法和Lowry法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。.一、凯氏定氮法凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为16%，通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。基本操作过程：①用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被还原成NH3，并形成(NH4)2SO4；②加入强碱，使硫酸铵释放出NH3，并将NH3收集在无机酸液中；③用标准碱溶液滴定，确定NH3量；④根据量确定样品含氮量，进而求得样品中的蛋白质含量。.(1)H2NCH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(2)2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(3)(NH4)SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3此法灵敏度低,适用于0.3-3.0µg氮,误差为2%,最大缺点是受样品中非蛋白质含氮化合物的影响。测定前需用蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。优点凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。1、酒精灯2、蒸汽发生器3、长玻璃管4、橡皮管5、小玻杯6、棒状玻璃塞7、反应室8、反应室外壳9、夹子10、反应室中插管11、冷凝管