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-1-新版药典变更解读——微生物相关分析质检中心微生物组2020年05月涉及内容药典三部：•生物制品通则：《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》•总论：《微生态活菌制品总论》（变更）通则•1101《无菌检查法》（变更）•1105《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》•1106《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》•1107《非无菌药品微生物限度标准》•3605《细菌生化反应培养基》•1421《灭菌法》•9202《非无菌产品微生物限度检查指导原则》•9203《药品微生物实验室质量管理指导原则》•9204《微生物鉴定指导原则》（变更）•9205《药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》（变更）通则新增•灭菌用生物指示剂指导原则（新增）•生物指示剂耐受性检查法指导原则（新增）•细菌DNA特征序列鉴定法（新增）一、《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》•菌毒种，系指直接用于制造和检定生物制品的细菌、支原体、立克次体或病毒等•生产和检定用菌毒种，来源途径应合法，并经国务院药品监督管理部门批准。微生物检测用菌来源：CMCC:中国医学细菌保藏管理中心CICC:中国工业微生物菌种保藏管理中心ATCC:美国微生物菌株保藏中心•生物制品生产用菌毒种应采用种子批系统。每批主种子批和工作种子批均应按各论要求保管、检定和使用。•菌毒种的传代及检定实验室应符合国家生物安全的相关规定。•各生产单位质量管理部门对本单位的菌毒种施行统一管理。•保管菌毒种应有严格的登记制度，建立详细的总账及分类账。收到菌毒种后应立即进行编号登记，详细记录菌毒种的学名、株名、历史、来源、特性、用途、批号、传代冻干日期和数量。在保管过程中，凡传代、冻干及分发，记录均应清晰，可追溯，并定期核对库存数量。•收到菌毒种后一般应及时进行检定。用培养基保存的菌种应立即检定生产用菌毒种应按各论要求进行检定销毁四类菌毒种须经单位领导批准。销毁后应在账上注销，作出专项记录，写明销毁原因、方式和日期。二、微生态活菌制品总论•微生态活菌制品必须由非致病的活细菌组成，无论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳定的活菌状态。它可由一株、多株或几种细菌制成单价或多价联合制剂。根据其不同的使用途径和方法可制备成片剂、胶囊颗粒剂或散剂等多种剂型。基本要求：微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证成品含有足够的活菌数量，保持其稳定性，同时应防止外源因子的污染。生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。生产用菌种生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定•名称及来源；•种子批的建立：三级种子批应分别冻干，置适宜温度保存；种子批传代应限定传代次数，原始种子批和主种子批启开后传代次数不得超过10代，工作种子批启开后至发酵培养传代次数不得超过5代。生产用菌种•种子批的检定：应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册和伯杰氏细菌命名手册的有关规定进行，形态、生长代谢特性检查。原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素敏感性等检查。三级种子批常规检查包括以下3项：（1）培养特性及染色镜检；（2）生化反应；（3）毒性试验•原始种子或主种子批还需进行以下检查（1）细菌代谢产物——脂肪酸测定（2）遗传特性分析（3）抗生素敏感性试验（4）稳定性试验生产用菌种原始种子和主种子应冻干保存于8℃以下，工作种子应置于适宜温度保存检定•微生态活菌制品质量检定应包括菌粉检定、半成品检定和成品检定菌粉检定1.外观2.目的菌检查取少量菌粉加入适量灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜稀释液后，涂布在适宜琼脂平皿上，在适宜条件下培养，其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征。3.杂菌检查方法和结果判断见本总论附录3。如不符合规定应废弃。4.干燥失重5.活菌数测定测定每克菌粉中含有的活菌数量。方法见本总论附录2。半成品的检定•半成品须做杂菌检查，根据用药途径确定杂菌检查的质控指标。方法和结果判断见本总论附录3。成品检定1.鉴别试验检查成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述“种子批的检定”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查，应符合规定。2.理化检查3.活菌数测定按本总论附录2方法测定每克制品中的活菌数，应符合规定。多价制品应分别测定各单价活菌数。4.杂菌检查方法和结果判断与半成品的“杂菌检查”项相同。5.安全试验（新版已删除）附录2微生态活菌制品活菌数测定法•无菌称取3.0g制品或菌粉（胶囊取内容物），加入27.0ml稀释液中，充分摇匀，做10倍系列稀释（最终稀释度根据不同的指标要求而定）。取最终稀释度的菌液100μl，滴入选择性琼脂培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，应调整最终稀释度，重新测定。•活菌数（CFU/g）=3个平皿菌落数之和/3*10*最终稀释度附录3微生态活菌制品杂菌检查法•微生态活菌制品杂菌检查法系检查微生态活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。检查项目包括控制菌检查，非致病性杂菌、真菌计数。变更：项目2015版药典2020版药典杂菌检查环境要求10000级下的局部洁净度100级不低于D级背景下的B级细菌培养温度30-37℃30-35℃真菌培养温度20-28℃20-25℃附录3微生态活菌制品杂菌检查法新增：由于供试品本身含有大量活菌，可能在杂菌检查所用的培养基上生长，干扰杂菌回收或结果判断，在建立或修订方法时应考虑其适用性，充分了解供试品活菌在杂菌检查培养基上的生长特性。除本附录收载的杂菌检查用培养基之外，亦可采用其他经验证的培养基。附录3微生态活菌制品杂菌检查法新增：如果供试品本身对某些试验菌具有较强的抑菌性能，影响试验菌的回收。在此情况下，应根据原辅料的杂菌负载、生产工艺及产品特性进行风险评估，保证检验方法的可靠性；在药品生产、贮藏各个环节中，应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受杂菌污染的风险。附录3微生态活菌制品杂菌检查法新增：控制菌检查法检出意思致病菌时，可参考“微生物鉴定指导原则（通则9204）”的提示进行后续确证，确证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法。检验量及供试品的准备•检验量，即一次试验所用的供试品量（g）。检验时，应从2个以上最小包装单位中随机抽取不少于3倍检验用量的供试品。•菌粉、半成品以及成品为散剂和颗粒剂的可直接称取备用；成品为片剂、胶囊剂的需研碎后备用。•供试品检查•阳性对照试验供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。取阳性对照菌于相应选择性培养基平皿上划线接种，按供试品的控制菌检查方法培养，观察菌落生长情况。阳性对照试验应检出相应的控制菌。•阴性对照试验取增菌液0.1ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。控制菌检查100μl•大肠埃希氏菌；•志贺菌、沙门菌；•铜绿假单胞菌；•金黄色葡萄球菌；•梭菌；•白色念珠菌；变更：项目2015版药典2020版药典增菌培养称取供试品1g，加到9ml灭菌增菌液中称取供试品1g，加到至少9ml灭菌增菌液中特异培养0.1ml100ul大肠埃希氏菌项目2015版药典2020版药典供试品检查中大肠埃希氏菌结果判定及下一步鉴定指导供试品平皿上若未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌；若生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征相符或疑似，应做革兰氏染色镜检等适宜的鉴定试验，鉴别是否为制品中的目的菌或大肠埃希菌。供试品平皿上若有疑似菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌或制品中的目的菌；若平皿上未见菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为非控制菌，判供试品未检出大肠埃希菌志贺菌、沙门菌项目2015版药典2020版药典供试品检查中志贺菌、沙门菌结果判定及下一步鉴定指导供试品平皿培养24小时、48小时各观察结果1次，若未见菌落生长，判供试品未检出志贺菌、沙门菌；若有菌落生长，应与阳性对照的菌落比较，并做革兰氏染色镜检等适宜的鉴定试验，鉴别是否为制品中的目的菌或志贺菌、沙门菌。若有疑似菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为志贺菌、沙门菌或制品中的目的菌；若平皿上未见菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为非控制菌，判供试品未检出志贺菌、沙门菌铜绿假单胞菌项目2015版药典2020版药典供试品检查中铜绿假单胞菌结果判定及下一步鉴定指导如平皿上无菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌；如平皿生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2-3个菌落，分别放在接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18-24小时。取斜面培养物进行革兰氏染色、镜检及氧化酶试验，鉴别是否为制品中的目的菌或铜绿假单胞菌供试品平皿上若有疑似菌落生长，取菌落分离、纯化后采用氧化酶试验及适宜的鉴定试验，确证是否为制品中的目的菌或铜绿假单胞菌增加：若平皿上未见菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为非控制菌，判供试品未检出铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌项目2015版药典2020版药典铜绿假单胞菌检测中氧化酶试验斜面培养物分离纯化培养物应进行绿脓菌素试验应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌删除：绿脓菌素试验金黄色葡萄球菌项目2015版药典2020版药典供试品检查中金黄色葡萄球菌结果判定及下一步鉴定指导供试品平皿上若未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符，判未检出金黄色葡萄球菌；若平皿上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2-3个菌落，分别放在接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18-24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰氏染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18-24小时，做血浆凝固酶试验。供试品平皿上若有疑似菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌或制品中的目的菌；若平皿上未见菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为非控制菌，判供试品未检出金黄色葡萄球菌删除：血浆凝固酶试验•控制菌检查用培养基的适用性检查变更:项目2015版药典2020版药典细菌增菌培养基营养肉汤培养基或营养琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基真菌增菌培养基改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基白色念珠菌涉及检验培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖液体培养基试验菌用量0.1ml100μl固体培养基促生长能力检查每种培养基平行制备2个平皿每种培养基每一试验菌株平行制备2个平皿非致病性杂菌、真菌计数•阳性对照•除另有规定外，真菌以白色念珠菌为对照菌，其他以金黄色葡萄球菌为对照菌•变更为：当采用营养琼脂培养基或玫瑰红纳琼脂培养基进行检查时，真菌计数以白色念珠菌为对照菌，非致病杂菌计数以金黄色葡萄球菌为对照菌•因供试品为活菌制品，应选用能抑制目的菌生长的选择性培养基进行检查。除另有规定外，营养琼脂培养基用于非致病性杂菌的计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于真菌计数。排除目的菌干扰的也可采用其它经验证的培养基真菌计数•称取供试品1g，加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，混匀，做10倍系列稀释，取适宜稀释度供试品溶液0.1ml加到已备好的玫瑰红钠琼脂培养基上，以玻棒涂匀，一式3份，倒置，于恒温培养箱中培养96小时，每天观察结果，记录平皿上生长的真菌菌落数.结果计算：以3个平皿上生长的菌落平均数计算。真菌数（CFU/g）=3个平皿菌落数之和/3*10*稀释倍数•计数培养基的适用性检查变更:项目2015版药典2020版药典细菌增菌培养基营养肉汤培养基或营养琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基真菌增菌培养基改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基细菌培养温度30-37℃30-35℃真菌培养温度20-28℃20-25℃试验菌用量0.1ml100μl结果判定被检培养基的菌落平均数与对照培养基的菌落平均数相比大于70%被检培养基的菌落平均数与对照培养基的菌落平均数的比值应在0.5-2范围增加：营养肉