色谱分离技术

第七章色谱分离技术随着科学的进步，某些关系到人们生命安全的生物药品，尤其是注射药品和生物工程产品等，都需要高度纯化。但是，经典的分离方法（如萃取、结晶等）很难满足需要。色谱法应运而生。产生的必然性色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离技术。是产品的最后纯化工序（精制），即在用色谱纯化之前需要经过其他方法进行提取和初步纯化。近40年来，色谱技术已成为生物大分子分离和纯化技术中极重要的组成部分。胰岛素、干扰素、疫苗、抗凝血因子、生长激素等。化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析过程中，待测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！20世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取。现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。1903年，俄国植物学家MikhailTswett最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素chlorophylls&xanthophylls)加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱(希腊语中“chroma”=color;“graphein”=write)。20世纪50年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展，复杂组分分析发展的要求）。年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究色谱分离基本原理：使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。处于柱起始端的样品中各组份与两相进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，而与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个组份的“带(band)”或“区(zone)”，对依次流出的各个组份物质可分别进行定性、定量分析。按照分离过程中相系统的形式和特征，可分为：柱色谱法填充柱色谱法毛细管色谱法平板色谱法纸色谱法薄层色谱法按流动相，可分为：气相色谱法液相色谱法超临界色谱法按固定相物态，气相色谱法可分为：气固色谱法气液色谱法按流动相物态，液相色谱法可分为：液固色谱法液液色谱法柱色谱法的分类见表8-1。按色谱动力学过程，可分为：洗脱色谱顶替色谱迎头色谱洗脱色谱(a)、顶替色谱(b)、迎头色谱(c)按组份在固定相上的物理化学原理，分为：吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；凝胶色谱:（尺寸排阻色谱）：不同尺寸分子在固定相上的渗透作用；1分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。2灵敏度高可以检测出10-11—10-13g的物质量。3分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。4应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。概述吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法高效液相色谱法亲和色谱法一、概述1.发展史创始人：茨维特（Tsweet）1906菊根粉或碳酸钙石油醚连续色带—色层或色谱色谱法得名纸色谱薄层色谱气相色谱高效液相色谱离子色谱、凝胶色谱、亲和色谱植物色素的石油醚提取液2.色谱法的特点（1）概念色谱法是一种物理的分离方法，利用不同物质在两相中具有不同的分配系数，并通过两相不断的相对运动而实现分离的方法。其中一相是固定相，通常是表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。流动相流经固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离；或者说，易分配于固定相中的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而逐步分离。（2）基本特点：①分离效率高。其效率是所有分离纯化技术中最高的，这种高效的分离尤其适于极复杂混合物。②应用范围广。（非）极性、（非）离子型、小分子和大分子、无机和有机及生物活性物质、热（不）稳定化合物；尤其是对生物大分子的分离，其他方法无法取代。③选择性强。可变参数很多：不同的色谱分离方法、固定相和流动相、操作条件。④设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件，因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子有机化合物。缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，工业生产上应用较少。3.色谱法的分类分离机理操作方法流动相的物态实验技术吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法亲和色谱法柱色谱法纸色谱法薄层色谱法气相色谱法液相色谱法迎头法顶替法洗脱分析法4.色谱分离方法的选择初级代谢产物：氨基酸、有机酸、核苷酸、单糖类、脂肪酸次级代谢产物：生物碱、萜类、糖苷、色素、鞣质类、抗生素生物大分子：蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖目的产物色谱分离方法的选择依据：①目的产物的分子结构、物理化学性质及相对分子质量；②主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质成分与含量；③目的产物在色谱分离过程中的生理活性的稳定性。二、吸附色谱法依靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附剂是一些多孔性物质，表面布满许多吸附位点，即活性中心。吸附色谱过程就是样品中各组分的分子与流动相分子不断争夺吸附剂活性中心并不断达到平衡的过程。被吸附的物质称为吸附物。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化学键。（一）基本原理溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。1.发生吸附作用的原理：固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子）所处的状态不同：固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处于平衡状态。界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零，合力指向固体内部。2.吸附的类型：物理吸附化学吸附交换吸附物理吸附化学吸附产生方式分子力（范德华力）库仑力(电子转移，生成化学键)活化能低高进行温度低温高温释放热量小很大速度较快，容易达到平衡慢，平衡慢选择性不严格强交换吸附：吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时放出等物质的量的离子，发生离子交换。离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多，在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸附。3.常用的吸附剂：有机吸附剂：无机吸附剂：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙、氢氧化铝按化学结构分4.吸附色谱的基本过程和分类固定相对各组分吸附力的大小次序：（1）过程（2）分类吸附薄层色谱法柱色谱法操作方法的不同5.吸附薄层色谱法（thinlayerchromatography,TLC）薄层色谱法：将吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上，铺成一薄层，然后把要分离的样品点到薄层的起始线上，用合适的溶剂展开，最后使样品中各组分得到分离。（1）原理：利用混合物中各组分的物理化学性质的差异，在层析过程中，在不相溶的两相中分布不同，从而达到分离的目的。吸附剂：涂布在薄层板上（固定相）展开剂：在展开过程中流过固定相的溶剂（流动相）两相将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开。当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同：对极性大的物质吸附力强，对极性小的物质吸附力弱。移动速度的不同：易被吸附的物质相对移动较慢，在薄层板上移动的距离就小；较难被吸附的物质移动较快，移动的距离大。经过一段时间的展开，不同物质就被彼此分开，最后形成互相分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，用特定的方法使斑点显色，达到定性和定量的目的。（2）吸附剂和展开剂的选择：吸附剂：氧化铝、硅胶和聚酰胺展开剂：由实验确定。极性越大，对物质的洗脱能力越强（3）基本操作薄层色谱板的制备点样展开显色①薄层板的制备：在一块玻璃板（薄厚一致，表面光滑平整）表面涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等。(--涂布)为了增加薄层的牢固性且易于保存，可在涂布过程中加入某些黏合剂。如羧甲基纤维素钠（CMC-Na）②点样：用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上。1.5–2cm直径3mm③展开：在密闭容器中进行：层析缸。最常用的展开法：上行展开法薄板放入层析缸时，切勿使溶剂浸没样品点。当溶剂移动到接近薄板上端边缘时，取出薄板，划出溶剂前沿。④显色：也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混合物各组分斑点呈现颜色。每类化合物都有特定的显色剂。各类物质常用的显色剂和万能薄层显色剂显色的方法：喷雾显色法紫外线照射法碘蒸气显色法生物显迹法有些化合物在紫外灯下会产生荧光或暗色斑点在充满碘蒸气的容器中，多数天然药物成分会产生棕色斑点抗生素等生物活性物质每类化合物都有特定的显色剂6.吸附柱色谱法（1）基本原理同薄层色谱法。吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺、活性炭（2）色谱柱：玻璃柱柱色谱装置（3）基本操作装柱上样洗脱吸附剂干法装柱湿法装柱被分离物质干法上样湿法上样梯度洗脱，各组分先后被洗出三、分配色谱法分配色谱法：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而进行分离的方法。分配色谱法：利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分布情况不同而使混合物得到分离。（相当于一种连续性的溶剂提取方法，只是把其中一个溶剂设法固定，用另一种溶剂来冲洗，这种分离不经过吸附程序，仅由溶剂的提取而完成，所以叫~。）（一）基本原理固定相：固定在柱内的液体流动相：用作冲洗的液体载体：使固定相停留在柱内的固体在洗脱过程中，流动相与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分布不同，因此向下移动的速度不同，易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动慢，因此得到分离。（溶解度）将含固定相的载体装在柱内加入被分离溶液洗脱分离：（二）载体、固定相和流动相的选择1.载体的选择惰性、无吸附能力、能吸留较大量固定相。主要有硅胶、硅藻土、纤维素，聚乙烯粉2.固定相的选择水、缓冲液、酸