酶联免疫吸附法检测梅毒抗体假阳性产生的原因

酶联免疫吸附法检测梅毒抗体假阳性产生的原因梅毒是苍白螺旋体引起的危害人类健康较为严重的一种性传播性疾病之一，近年来在我国的发病率呈逐年上升的趋势，对梅毒作出快速、准确的诊断是非常重要的。目前临床上梅毒的诊断主要是根据临床症状和血清学检查，酶联免疫吸附法(ELISA)对IgG、IgM都有很好的检测能力［1］，因其灵敏度高、价格低廉、操作方便、结果客观在国内广泛使用。但在工作中遇到的最大问题是出现假阳性的问题，而大多数是由于弱阳性反应引起的，这给医疗工作带来麻烦，甚至引起医疗纠纷。为避免假阳性结果的出现，现将产生假阳性的原因作以总结，供同仁参考。1机体的内在因素1.1年龄因素有些老年人梅毒检测结果阳性，而无临床症状，也无发病史和疾病接触史［2］。ELISA试剂盒主要是选自梅毒螺旋体外膜的脂蛋白47KD、17KD、15KD为分子抗原，用基因重组表达和BOC再用人血清白蛋白与之连接，而且合成后的多肽一般不做提纯，直接作为试剂抗原使用。由于抗原不纯和使用了人血清白蛋白，增加了意外假阳性抗原位点的可能。老年人容易出现免疫功能的异常，易产生一些针对连接用的白蛋白的抗体或一些异常蛋白质而干扰了检测的结果出现假阳性。1.2疾病因素有些疾病如其他螺旋体感染、淋巴肉瘤、糖尿病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、丙型肝炎、肝硬化、海洛因成瘾、妊娠等可使患者体内含有治疗性抗体、嗜异性抗体、自身抗体、类风湿因子、甲胎蛋白等。这些特殊成分在反应过程中有一定的吸附作用，产生假的显色反应而出现假阳性。2标本因素2.1标本处理不完全血液抽取后未完全凝固即离心分离血清，纤维蛋白未完全析出，容易在板孔中形成纤维蛋白薄膜或絮状物，造成洗板时清洗不干净，酶残留在相应的板孔中，使吸光度值偏高，造成假的阳性结果。2.2标本溶血标本溶血时细胞内液的各种活性酶及具有酶样活性的物质可与底物非特异性结合；Hb具有类过氧化物酶的活性，其效应与辣根过氧化物酶类似，溶血后反应孔非特异性吸附Hb，洗涤时不易洗去，催化底物产生一定程度的显色，使本底吸光度值升高而造成假阳性［3］。2.3标本被细菌污染标本采集后及分离血清时应避免细菌污染，因一些细菌体内可能含有内源性辣根过氧化物酶，会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰，造成弱的假阳性结果。2.4标本保存不当标本在冰箱存放过久，易使细菌繁殖，会影响结果的测定；存放过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，导致本底过深，造成弱的假阳性。3操作因素洗涤过程中有溢出现象，使强阳性标本的反应液污染临近的阴性孔而出现假阳性；洗涤时间短或洗涤次数少，使洗涤不充分，板孔中酶试剂残留而出现假阳性；底物液反复使用被污染或受到强光照射时间过长也会出现假阳性；判读结果或登记、发报告时错位，出现错报的假阳性结果。4仪器因素4.1酶标仪使用的影响酶标仪是ELISA试验所必须的仪器，它是对反应孔进行垂直比色，当反应板底部有污染时，容易出现吸光度值升高，导致假阳性的结果。4.2拖带阳性全自动加样仪加样时不是一份标本一个加样头，虽然仪器能对加样针内壁和外壁自动清洗，但遇到高浓度抗体标本时，由于加样针清洗程度不够，同一加样针拖带污染导致其后一孔甚至多孔出现假阳性的现象［4］。5方法学因素5.1灰带区现象梅毒ELISA测定是一种定性试验，须在阳性与阴性之间有一条明确的分界线，即阳性判定值(Cutoff)，通常将以Cutoff值左右的一定范围定为灰带区［5］。测定结果在灰带区的标本易出现假阳性，应通过确认试验或跟踪检测来确定是阳性还是阴性。5.2空白对照的影响用单波长法测定ELISA结果时，设置空白对照对测定结果的准确性有很大的影响。由于反应孔有划痕，可使测定A值升高，如果不设空白对照，判读结果时可引起假阳性。在工作中出现可疑的阳性标本时，应仔细查找干扰因素，并重抽血复查，如果还不能确定的标本应建议其定期随访，用PCR检测梅毒DNA，必要时做确认试验来确定结果，避免假阳性报告的发出，以减少医疗纠纷。解放军304医院皮肤科邹先彪：梅毒血清学试验有两类，一类是非特异性试验，包括RPR、VDRL、USR和TRUST。由于其采用的是非密螺旋体抗原（即正常牛心脂质）测定患者血清中的反应素，反应素也可在某些非梅毒患者及正常人血清中出现，故可呈生物学假阳性。另一类是特异性试验，包括TPELISA、TPHA、TPPA、FTABS、金标免疫层析法及免疫印迹试验，其采用Nichols株螺旋体或纯化的、基因重组的梅毒螺旋体抗原测定血清中的特异性抗体。试验的特异性可达到99%左右，但不能绝对排除假阳性。目前国内最常用的梅毒血清学初筛试验是以心拟脂为抗原的非特异性梅毒血清学试验，目前主要有TRUST和RPR，其所检测的抗体并非抗梅毒螺旋体抗体，而是梅毒螺旋体感染人体以后分解破坏人体组织，其分解产物释放到血液中，使人体产生抗体。分解释放的产物即是心拟脂，所产生的抗体即是反应素。据文献记载，除梅毒外尚有其他一些感染和免疫性疾病也可使人体组织受损释放心拟脂到血液中，使人体产生反应素，而使RPR或TRUST出现生物学假阳性反应。并将生物学假阳性反应分为急性和慢性两种。急性生物学假阳性反应见于病毒性疾病，如风疹、麻疹、水痘、传染性单核细胞增多症、病毒性肝炎;其他如疟疾、活动性肺结核、丝虫病、鼠咬热、回归热、钩端螺旋体病等，多于6个月内消失。慢性生物学假阳性反应常见于麻风、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、桥本甲状腺炎、结节性多动脉炎、风湿性心脏病以及海洛因吸毒成瘾者等，反应持续时间可长达数年或终身。生物学假阳性反应的RPR或TRUST定量滴度一般≤1:8，而未经治疗的二期显发梅毒RPR或TRUST定量滴度一般≥1:16。TPHA等特异性梅毒血清试验假阳性的主要原因有自身免疫病、皮肤病、心血管病、麻风、热性病、老年人、莱姆病、地方性密螺旋体病等因素。为正确判断检测结果是否为假阳性反应，往往需要医生的综合判断分析，如详细询问患者有无不洁性生活史、性病史、流产史、抗梅治疗史；还要认真查体，注意患者是否有梅毒体征；是否为老年人。资料显示老年人梅毒血清学特异性试验假阳性率偏高。