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第一章设备与器械1目的规范实验室用房，确保实验室工作和业务用房的正常需要，以促进科室的发展，确保各项工作顺利进行。2实验室用房规范与要求细胞遗传学实验室一般分为洗涤室、培养室、细胞学处理室、阅片室、暗室、档案室。其要求一般与其他普通实验室的要求基本相同:1.便于所有器具的清洗。2.便于准备消毒及各种试剂的保藏。3.便于使用各种方法检测待检标本，进行细胞遗传学方面的临床诊断。但同时需要具有暗室并具有符合医疗档案存放的档案室。2.1洗涤室玻璃器皿的清洗、包装，培养物质的准备与消毒，供应物品的保藏等工作都需在洗涤室里进行，洗涤室的大小一般为4m×6m，洗涤室应设有下列设备：1.一个清洗玻璃器皿的水槽，便于清洗、晾干；2.电热干燥消毒箱，用于玻璃器皿的干热灭菌；3.高压蒸汽灭菌锅，用于不能耐受干热灭菌物品的处理；4.烤箱两个便于烤干玻璃器皿或高压蒸汽灭菌物品；5.石英玻璃双重蒸馏器或超纯水装置，用于蒸馏水或超纯水的制备；6.真空泵一个，以备配制培养基过滤时用；7.物品准备台，以备包裹玻璃器皿等；8.储柜或储架，便于清洗干燥的器皿或其它物品存放；9.酸缸，一般最好是耐酸材料，用于盛装清洗液，清洗液多为含重铬酸钾的硫酸溶液。2.2培养室中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号1.1实验室用房使用规范发布日期实施日期培养室包括操作间和缓冲室，操作室功能是进行无菌操作和细胞培养，如各种组织取材与接种材料的准备、培养物的生长状态观察等，因此应配有超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、小型低速离心机、冰箱、玻璃柜等。缓冲室则是供工作人员进入培养室前换消毒衣服、鞋、帽等之用。培养室一般3m×3m已够用，要求清洁、干燥、不通风、光线适宜。操作间必须墙壁光滑并装有空调器，操作间与外间实验室之间最好有传递窗，以便传递临时需用的实验用品。培养室空气消毒可采取紫外线消毒或空气净化。2.3细胞学处理室细胞学处理室需要配备普通离心机、恒温水浴箱及恒温电烤箱（烤片用）等，主要用于染色体的收获与显带。2.4暗室暗室用于对荧光原位杂交技术结果的观察和分析，配备荧光显微镜和分析系统。1目的规范各类仪器的正常使用和保养，延长仪器的使用寿命，确保各结果的准确性。2仪器使用环境：1）无灰尘、通风环境良好。2）避免阳光直射。3）室内温度18～30℃，变化不超过±2℃4）室内湿度2～80%RH。5）电源电压变化再20V±10V之内，5m内不能有配电器。3使用仪器程序3.1超净工作台超净工作台是目前实验室内普遍应用的无菌操作装置，在超净工作台内进行无菌操作，可明显地减少细菌污染的机会。超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气，通过高效空气微粒滤层净化，使操作范围形成无菌环境。3.2CO2培养箱实验室一般应置备二台CO2培养箱，将来自同一标本的培养瓶分两线放入不同的培养箱内培养，以保证细胞培养的成功率。CO2培养箱常见的是隔水式培养箱。培养的细胞需要一个恒定的温度，过低或过高的环境温度均可导致细胞死亡，因此对培养箱的灵敏度要求在±0.5℃。此外，一定浓度的CO2也是细胞培养所必需的。CO2培养箱可恒定地提供细胞所需的CO2（通常是5%）,使培养液的pH值保持稳定，适用于开放性培养。使用时应注意每三个月定期校正，如有异常应及时调整。培养箱内空气必须保持清洁，应定期用酒精擦拭消毒，消毒时每层隔板均需洗刷干净，并用75％酒精纱布擦拭。每周定期更换箱底水盘中的水，以中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号1.2各类仪器设备标准操作规程发布日期实施日期保持相对湿度。为防污染可在水盘内加入1‰新洁尔灭。箱内高效空气过滤器堵塞时，指示灯提示后需及时更换3.3烤箱烤箱用于玻璃器皿的烘干和干热灭菌，一般以650mm×500mm×500mm的比较适用。烤箱都装有鼓风装置，鼓风与升温同时开始。干热灭菌物品时一般为180℃维持1.5h，灭菌后应待箱内温度下降至80℃时方可开门，以免骤冷而致玻璃器皿损坏。应注意的是橡皮制品、塑料培养板、有机玻璃制品禁用烤箱灭菌。3.4恒温水浴锅恒温水浴锅是实验室不可缺少的设备。主要用于显带处理和培养基的加温。由专人负责每周更换蒸馏水并添加防腐剂。3.5水纯化装置离体培养的细胞对水的要求特别高，培养细胞用的器皿清洗最后一道程序应用二蒸水冲洗，培养基的配制也应用二蒸水或超纯水。目前常用的有自动双重纯水蒸馏器（石英管加热），因为普通的橡皮对细胞是有毒的，所以制备好的二蒸水应避免通过橡皮管放出。3.6冰箱实验室必须配备有普通冰箱和低温冰箱（-20℃），普通冰箱用于培养液、生理盐水、Hanks溶液等试剂和标本短期的存放，低温冰箱用于贮存需要冷冻保持生物活性及长时间存放的试剂如血清等。3.7细胞冷冻贮存器细胞冷冻装置一般分为运输用和储存用二种液氮罐，用于细胞株和标本的保存，液氮罐双层结构中间为真空层，其内胆颈部与体部经焊接相连，故搬动和装入液氮时，应缓慢加入，使容器内的温度均匀下降，有条件可配备有程控降温仪的液氮储存系统，该系统的特点是可自动控制冷冻箱的降温速度。3.8离心机细胞培养需要经常消化分离细胞、漂洗制备细胞悬液和进行传代以及染色体的收获，因此接种培养室与细胞处理室内可各配置一台可调速的小型台式离心机。3.9高压蒸汽灭菌装置高压灭菌是利用高压蒸汽使细菌体内蛋白凝固而达到灭菌，是最常用的灭菌方法。在115.5℃，30分钟就能杀死所有繁殖型细菌的芽胞。高压蒸汽灭菌比其它灭菌方法效果都好。由于蛋白质的凝固需有水分存在，当细菌体内含有水分在25％以下时，蛋白质的凝固温度如下：水分含量凝固温度25％74-80℃8％80-90℃6％145℃由此可见，在细菌体内有水分存在的条件下可以大大降低灭菌所需的温度。高压灭菌主要用于细胞培养所需的二蒸水、生理盐水、手术器械、布类、橡皮类等。4显微镜与细胞遗传图象分析工作站显微镜是分析染色体的必备工具，一般要求每位实验室技术人员配备一台。有条件的实验室可配备细胞遗传图象分析工作站。4.1维护保养记录4.1.1每日保养每日登记各仪器的运行和使用情况，保证每台仪器的正常运行。4.1.2每周保养每周对各仪器进行清洁维护，检查各仪器是否存在各类使用的隐患。4.1.3每月保养每月不定期的对各仪器进行抽样检查运行使用情况的检查。5小型设备5.1天平普通称量0.1克的电子天平以及分析天平是实验室所必需的，要求每年做一次校正。5.2真空泵培养液的配制都用过滤的方法进行除菌，一般30升旋转式的真空泵即可。5.3酸度计又称为氢离子测定计或pH计，是测定各种液体酸碱度的必须工具，要求每半年做一次校正。5.4加样器加样器是细胞培养不可缺少的用具，其规格有0.5-10ul、10-100ul、100-1000ul,末端可安装不同容量吸管，吸入和注入液体较方便。使用时吸入的液体量不能在其设定范围之外，而且要求每半年做一次校正。5.5常用玻璃器皿及器械培养器皿是供细胞接种生长等用的器皿，可用透明度好，中性硬质的玻璃制成。另外，还可使用透明、平滑、无毒、干净并经放射性核素照射灭菌密封包装的一次性使用塑料培养器皿，其优点是打开包装即可用于培养操作，缺点是费用较高。目前国内一般实验室使用的还是玻璃器皿。5.5.1溶液瓶其规格常为500ml、250ml、100ml的配胶塞的盐水瓶和配塑料螺旋盖的盛液瓶，用于贮存各种试剂等。5.5.2培养瓶有玻璃和塑料二种，常用的规格有25cm2(70ml)和75cm2（275ml），160-175cm2（600ml）等规格，国内培养瓶常用的规格有25ml，100ml和250ml等规格，主要用于细胞培养，早期的玻璃培养瓶是用胶塞封口，仅能用于密闭培养，现被螺旋盖培养瓶取代。螺旋盖培养瓶适宜在CO2培养箱中使用，瓶的底壁是供细胞贴壁生长的生长面，而其它内壁为非生长面。5.5.3培养皿有玻璃和塑料二种，常用的有120mm，100mm和60mm等规格，主要用于培养和分离组织用，也可用作单细胞分离及单层细胞贴壁培养等实验，。5.5.4多孔培养板材料仅有塑料的一种，其规格有96孔，24孔，12孔，6孔，4孔，用于少量细胞或单个细胞的克隆生长，细胞转化及细胞毒性等各种检测实验。5.5.5吸管有玻璃和塑料二种，主要用于移送培养基，玻璃吸管有直头和弯头二种，直头吸管用于吸加少量培养基，加抗菌素，加NaHCO3、调pH等用；弯头吸管用于吹打分散和混悬细胞用。5.5.6离心管有玻璃和塑料二种，主要用于离心、漂洗和分离细胞，常用的规格有50ml，10ml，5ml三种规格，此外还有微量离心管，规格有1.5ml，1ml，0.5ml，以供贮存少量试剂或其它实验用。5.5.7器械主要用于取材和原代培养中切割组织。常用的器械有：组织剪、镊子等。使用过程中应注意保护刀锋，用毕擦净、晾干、以防生锈，消毒以煮、高压灭菌或75%酒精浸泡。5.5.8其它如配制溶液的量筒、容量瓶以及试管、高压消毒用贮槽、铝饭盒、各种胶塞、冻存管、铝制吸管筒、各种试管架、研钵、各种橡皮塞、洗耳球、滴头、烧杯、玻棒、各种大小规格不同的试剂瓶、载玻片、盖玻片、针头式塑料抽滤器、0.45um醋酸纤维膜、酸缸、各种泡酸用的耐酸尼龙网袋、铜丝筐、耐酸手套、试剂瓶冲洗器、记号笔、染色缸、染色架、玻片板、酒精灯。第二章培养用品的清洗及准备1洗涤液的配制1.1重铬酸钾清洁液的配制1.1.1配制方法按比例称取置于特制的耐酸酸缸内（50克重铬酸钾加1000ml水），加热使其溶解，冷却后再慢慢加入工业粗硫酸（90ml粗硫酸），注意切不可将水加入硫酸中，边加边搅拌。配好的清洁液为深褐色。清洁液的配制，可分为强酸溶液与弱酸溶液（见表1.1）可视需要而选用表1.1清洁液的配方成分强酸溶液弱酸溶液重铬酸钾（g）120g50g浓硫酸（ml）160ml90ml蒸馏水（ml）1000ml1000ml1.1.2配制清洁液的注意事项：1．戴防护面罩、手套、围裙等。2．如不慎将清洁液洒出，应用沙土吸附，用塑料簸箕收起，然后用水冲洗。3．配制时切记千万不要以水加入硫酸，以防大量产热使容器爆裂而造成事故。4．一定待清洁液冷却后再放入容器中，以免热胀冷缩而使容器破裂，造成事故。1.1.3使用硫酸清洁液的注意事项：1.硫酸为强吸水性物质，故泡酸的器皿一定要晾干，不要带水太多，这样可延长使用时间。2.用碱处理过的器皿必须冲洗干净才可放入清洗细胞培养专用的酸缸。中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号培养用品的清洗及准备发布日期实施日期3.硫酸比重大，应注意安全，不可单手握装满洗涤液的量筒等，以防掉在地上打破容器。4.如不小心将硫酸溅到眼里，要尽快用水冲，并用眼杯装3％NaHCO3溶液清洗。5.当清洁液的颜色发绿或混浊时，说明使用过久，效力降低，应重新配制。2玻璃器皿的清洗细胞培养中，玻璃器皿的清洗是个十分重要的环节，清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明，无油迹，且不能残留任何有毒物质，一般玻璃器皿的清洗包括刷洗、浸酸和冲洗三个步骤。2.1刷洗将待清洗的玻璃器皿在洗涤液中煮沸30分钟后进行刷洗，刷洗时应注意二点，一是要选用软毛毛刷，刷洗时用力要轻，使用多次的毛刷要更换，防止损伤器皿表面或造成划痕；二是刷洗时不能留下死角，刷洗后，用自来水彻底冲洗，稍晾干，浸酸。2.2浸酸浸酸是将刷洗和晾干后的玻璃器皿浸泡到由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水配制的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能残留的有机物，浸泡时一定要使器皿完全浸入清洁液中，器皿中不能有气泡，浸泡时间4小时以上。2.3冲洗浸酸后的器皿必须用自来水冲洗干净，冲8-10次后再用一蒸水冲二次，二蒸水冲一次，整个冲洗过程应连续进行。3胶塞和塑料用品的清洗3.1胶塞新购置的胶塞有大量滑石粉应先用自来水冲洗干净后，再作常规处理。常规清洗方法是每次用完的胶塞要置入水中浸泡，然后用洗洁精或2%NaOH煮沸10分钟，自来水冲洗晾干后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟到4小时，用自来水冲洗干净，最后分别用一蒸水和二蒸水各煮沸两次，二蒸水冲洗，晾干备用。