实验--MS培养基母液和常用试剂的配制

实验1胡萝卜愈伤组织的诱导培养实验内容：1-1MS培养基母液和常用试剂的配制1-2胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制1-3胡萝卜愈伤组织的诱导1-4胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制1-5胡萝卜愈伤组织的继代培养实验1-1MS培养基母液和常用试剂的配制1实验目的通过本次实验，使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。2实验原理培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。3主要实验用具和仪器冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、pH试纸（pH5.4~7.0），电磁炉等。4药品和试剂硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT、浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、重铬酸钾、95%酒精、蒸馏水等。5MS培养基母液和常用试剂的配制流程5.1培养基的成分目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。5.2培养基的配制方法配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。最后调节pH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制：一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在2～4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。此法较为常用。5.3MS培养基母液的配制母液的配制有两种方法：一种是配制成单一化合物母液。此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。另一种是配成几种不同化合物的混合母液。此法在大量配制同种培养基时省时省力。由于MS培养基较为常用，故配制MS培养基母液。配好的母液应放在试剂瓶中贮存。在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。5.3.1大量元素母液的配制MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2•2H20、MgSO4•7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。注意：CaCl2•2H2O最后加入母液种类成分规定用量/mg•L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1LMS培养基吸取取量/ml大量元素KNO319002038000100050NH4NO3165033000CaCl2•2H204408800MgSO4•7H2O3707400KH2PO417034005.3.2微量元素母液的配制MS培养基中的微量元素可由MnSO4•4H2O、ZnSO4•7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4•2H2O、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见下表）。配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）。母液种类成分规定用量/mg•L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1L培养基吸取量/ml微量元素MnSO4•H2O16.9200338010005ZnSO4•7H2O8.61720H3BO36.21240KI0.83166Na2MoO4•2H2O0.2550CuSO4•5H2O0.0255CoCl2•6H2O0.02555.3.3有机成分母液的配制MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。亦可配制成混合母液（不主张采用）。母液种类成分规定用量/mg•L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1LMS培养基吸取量/ml有机成分甘氨酸2.02001002505盐酸硫胺素0.15盐酸吡哆素0.525烟酸0.525肌醇10050005.3.4铁盐母液的配制铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8→定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。用时每配lL培养基取该溶液5ml。母液种类成分规定用量/mg•L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1LMS培养基吸取量/ml铁盐Na2EDTA•2H2O37.320037305005FeSO4•7H2O27.827805.3.5植物生长调节物质母液的配制对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或ppm较为方便，一般配制成0.1-1mg·ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；6-BA/KT应先溶于少量1mol·L-1的HCl中，再加水定容。具体配制见下表：母液种类成分称取量(mg)母液定容体积(ml)母液浓度(mg/ml)生长素2,4-D501000.5NAA501000.5细胞分裂素6-BA101000.1KT101000.15.3.6其它常用试剂的配制盐酸（lmol·L-1）：用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制氢氧化钠（lmol·L-1）：用固体氢氧化钠配制75%酒精(v/v)：用95%的酒精来配制稀铬酸洗涤液：重铬酸钾50g溶于1000ml蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90ml。配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。母液最好在2～4℃的冰箱中保存。尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。注意事项：（1）玻璃器皿的洗涤（2）天平的使用（3）配制大量元素母液时溶液的混合顺序（4）铁盐的配制（5）洗液的配制（6）生长调节物质的配制作业：待本实验全部完成后撰写综合性实验报告。报告空表自己到教务处网站下载。本次要求详细写出MS培养基母液和常用试剂的配制流程。