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纯化前准备1.推荐在中性至弱碱性条件下（pH7-8）结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液，Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂。3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6M盐酸胍或8M尿素4.避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等5.各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；6.不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；7.缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）8.缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染注：1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH值法等可被应用，详见说明书Bindingbuffer中咪唑的浓度在洗涤时所用的Bindingbuffer中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。Buffer的准备所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer在使用前需经0.45μm滤膜过滤。所用高纯度的咪唑需在280nm处无吸光度或吸光度极低。推荐buffer（使用前用0.45μmfilter过滤）Bindingbuffer：20mM磷酸盐0.5MNaCl20-40mM咪唑pH7.4（咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elutionbuffer：20mM磷酸盐0.5MNaCl500mM咪唑pH7.4（咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）1.样品准备样品需被充分溶解。过柱前经0.45μm滤膜过滤。样品以pH7.4bindingbuffer溶解。勿用强酸强碱调节pH值，否则将可能导致沉淀。2.重力纯化法Ni-NTAColumn准备1.温和地颠倒瓶中的Ni-NTAAgarose数次。2.吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10minutes)或低速离心(5minuteat500×g)，轻柔的吸出上清。3.加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心5minuteat500×g，轻柔的吸出上清。4.用bingdingbuffer重复第3步。5.在Ni柱中加入等体积的bingdingbuffer，制成50%的slurryNi柱子的beads浸泡在20%ethanol中，倾除20%ethanol溶液，用蒸馏水将beats调成75%（v/v）的浓浆状的凝胶。.沿玻璃棒一次倒入柱子中，静置。3.样品与Ni柱结合1.每1ml50%的slurry中加入4ml的样品。1ml50%的slurry可结合20mgHis-蛋白2.将混合物室温，低速振荡孵育1h4.Buffer洗涤及洗脱1.离心5minuteat500×g，轻柔的吸出上清。上清保存放在4℃forSDS-PAGEanalysis。2.用1mlBindingBuffer洗涤柱子，在摇床上温和的振荡2min，然后低速离心5minuteat500×g，小心吸出上清，重复该步一次。上清保存放在4°CforSDS-PAGEanalysis。3.用0.5mlElutionbuffer洗脱柱子，方法同4。重复该步三次。分管收集4次洗脱液，存放在4°CforSDS-PAGEanalysis。纯化柱的再生：如果纯化同一种蛋白，Ni-NTAresin不需要再生，可以重复使用5－7次。1.用5倍柱体积的含50mMEDTA，20mM磷酸盐，0.5MNaClpH7.4的buffer洗涤柱子，洗去螯合的镍离子。2.用5倍柱体积的bindingbuffer洗涤柱子3.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子4.用0.5倍柱体积的含0.1M的NiSO4的无菌水溶液装填5.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子6.用5倍柱体积的bingdingbuffer洗涤柱子7.加入20％的乙醇4-30℃长期保存。lysisbuffer中加咪唑的目的是与杂蛋白竞争，使那些与填料亲和力弱的杂蛋白不能挂柱；washbuffer中加咪唑是为了洗去大部分已挂柱的杂蛋白（也会洗去少量目的蛋白）；elutionbuffer中加梯度咪唑，而且咪唑浓度渐高，是咪唑和目的蛋白竞争性结合填料，从而把目的蛋白从柱上洗脱。层析柱再生1.除镍①10倍柱床体积的strippingbuffer洗柱，1ml/min②10倍柱床体积的bindingbuffer洗柱，1ml/min(可省)③10倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min2.除去柱上残余蛋白①1MNaOH充满柱并保持2h②10倍柱床体积的bindingbuffer洗柱，1ml/min(可省)③10倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min3.挂镍①0.5倍柱床体积的0.1NiSO4洗柱，1ml/min②5倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min③5倍柱床体积的bindingbuffer洗柱，1ml/min4.20%乙醇过柱，4℃保存注：strippingbuffer：2mMNa3PO40.5MNaCl50mMNa2EDTApH7.4蛋白纯化Elutionbuffer洗柱①10倍柱床体积的bindingbuffer平衡②样品过滤，上样（关阀门，15min）③10倍柱床体积的bindingbuffer洗柱④Elutionbuffer洗脱蛋白（一般蛋白位于前5ml）⑤超滤管10000rpm，浓缩离心10min注：500mlBindingbuffer：20mMNa3PO420×10-3×0.5×380.16=3.8g0.5MNaCl0.5×0.5×58.5=14.625g5mM咪唑5×10-3×0.5×68.09=0.17gpH7.4（咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）500mlElutionbuffer：20mMNa3PO420×10-3×0.5×380.16=3.8g0.5MNaCl0.5×0.5×58.5=14.625g500mM咪唑0.5×0.5×68.09=17gpH7.4（咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）