X-tremeGENE-siRNATransfection-Reagent中文说明书

仅供生命科学研究使用。不可用于诊断程序。X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent用于动物细胞的siRNA转染货号：044760930011ml货号：044761150015×1ml（2000次转染反应）保存温度：+2至+8℃1.产品用途实验次数按照标准程序，1mlX-tremeGENEsiRNATransfectionReagent用于HeLa,NIH3T3,HEK-293等细胞的转染，在24孔板中的转染反应可至少进行400次；96孔板的转染反应，可至少进行1600次。试剂成分X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent是一种脂质与其他组份构成的混合液，经0.2μm膜过滤，装载于聚丙烯材质的管中。不含任何人源或动物来源组份。保存与稳定性X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent于+2至+8°C条件下密闭保存，试剂可保持稳定性达标签注明的失效日期。请勿冻存X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent，每次使用试剂前漩涡1s或倒置混合均匀。所需的其他设备与试剂使用X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent进行转染所需的其他试剂与设备包括：将灭菌的无血清培养基（SFM）预热，培养基中勿添加其他附加成分和补充因子。建议使用Opti-MEMI培养基稀释siRNA和X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent.预转染的哺乳动物细胞系。siRNA溶液，浓度在0.2μg/μl（15pmoles/μl,[15μM]）至2μg/μl（150pmoles/μl,[150μM]）之间。应用X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent是一种多组分的高性能转染试剂，可以与siRNA形成复合物并高效输送至动物细胞。X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent的特性如下：该试剂被设计用于广泛细胞系的转染，包括HeLa，NIH3T3，HEK-293，PC-3，COS-7等。单一试剂可同时用于siRNA-或siRNA/质粒的共转染实验。细胞毒性低，转染后不需要更换培养基。在有无血清的转染条件下，保持同等高效的转染性能，转染前后均无需更换培养基。2.如何使用本产品2.1实验开始前siRNA纯度，荧光标记的siRNA通过OD260nm/OD280nm的比值测定评估siRNA的纯度，转染实验用的siRNA纯度比值应1.9。如果前期通过体外转录反应制备siRNA，需控制siRNA长度在30bp以内。成熟的动物细胞对长片段的siRNA会呈现一种干扰素应答，导致翻译过程受阻。Kimetal[1]曾报道，必须去除体外转录siRNA的5´端的三磷酸残基，以防干扰素应答。通常生物技术服务商合成的siRNAs纯度和质量是适用于转染实验的。细胞培养条件为最小化实验内及实验间的转染效率差异，使用定期传代、增殖情况良好的处于对数生长期的细胞，始终使用一致的细胞密度进行接种。培养基和其他培养添加物（血清等）①对于某些细胞类型，细胞培养基中通常添加有抗微生物制剂（例如：抗生素与抗真菌制剂），这些添加物会降低X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent的转染效率。如可能，在初始实验中去除这些添加物。建立高效转染条件后，可重新进行添加，但同时需监测转染效率。②培养基类型和成分（如血清质量）会影响到细胞生长与/或转染效率，以及靶基因的沉默效率。建议尝试不同的培养基，优化其中的组分，观察其对转染效率的影响。转染时可以使用各种适合的培养基。但对于siRNA和X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent的稀释，建议使用Opti-MEMI培养基。③siRNA和X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent形成的转染复合物不会对转染后的细胞造成明显毒性，因此转染后无需更换培养基。但是对于长期培养来说，需要定期更换新鲜培养基以维持细胞良好的生长条件。特别是对于一些稳定表达蛋白的基因沉默研究，需要3-7天的转染后培养周期，以获得最大的沉默效率，必须定期更换新鲜培养基。转染效率评估基因沉默效率取决于研究使用的细胞系和研究的基因，对于实验室使用的新的细胞系，建议转染后评估转染效率。例如通过人内源性管家基因HPRT的qPCR检测基因沉默效率；或通过WesternBlot检测内源性基因laminA/C的表达情况，确定沉默效率。版本05目录版本：2011年2月培养时间转染后细胞培养时间一般在24-72h。具体的培养时间需根据siRNA、转染细胞类型、mRNA和目标蛋白的稳定性来决定。培养后通过合适的分析方法检测基因沉默效率。2.2实验流程转染用细胞制备转染前一天消化细胞、调整细胞浓度后接种细胞于合适的培养容器中。对多数细胞类型，24孔板中每孔加入0.45ml培养基，接种0.1-0.8×105个细胞，过夜培养后可达到30-50%的汇集度。对于其他规格的培养容器，请根据表1调整培养基体积，及siRNA和转染试剂的用量。转染复合物比例初期优化时建议制备3种不同浓度比例的转染复合物。24孔板中细胞转染，X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent:siRNA的复合物制备为优化转染复合物比例，进行X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent（μl）与siRNA（μg）比值为10:2、2.5:0.5、1:0.2的3种不同比例试验。研究结果显示，这3种比例范围适用于各种常用的贴壁细胞转染，能获得高效基因沉默。使用不含血清的培养基稀释X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent和siRNA复合物。使用不含血清和抗生素的培养基稀释X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent（建议使用Opti-MEMI培养基）。首先在管中加入无血清培养基。试剂加入的先后顺序对实验结果十分关键。标记3个无菌小管：10，2.5，1。在第1管中加入40μl无血清培养基，第2和3管中分别加入47.5μl和49μl无血清培养基。将X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent（分别取10μl、2.5μl、1μl加至相应标记的管中）直接添加至培养基中，切勿接触到塑料管壁。用枪头小心混匀。管子标记SFM（μl）转染试剂（μl）1040102.547.52.51491勿振荡混匀。为保证转染效率，避免将未稀释的X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent直接接触到塑料材质表面，如含培养基的试管壁。转染试剂稀释后的5分钟内必须加入siRNA（见）。使用不含血清和抗生素的培养基稀释siRNA（建议使用Opti-MEMI培养基）。首先在管中加入无血清培养基。试剂加入的先后顺序对实验结果十分关键。标记3个无菌小管：50+2，50+0.5，50+0.2。按下表加入无血清培养至终体积50μl。管子标记SFM（μl）+siRNA(μg)终体积（μl）50+250+2(150pmoles)5050+0.550+0.5(40pmoles)5050+0.250+0.2(15pmoles)50将siRNA（分别取2μg、0.5μg、0.2μg加至标记的管中）直接添加至培养基中，切勿接触到塑料管壁。用枪头小心混匀。勿振荡混匀。为保证转染效率，避免将未稀释的siRNA直接接触到塑料材质表面，如含培养基的试管壁。siRNA稀释后的5分钟内必须与稀释的转染试剂混合（见）。转染复合物的混合和孵育。将步骤1和2中稀释的转染试剂和siRNA按标签混匀。-标记10的稀释转染试剂与50+2混匀-标记2.5的稀释转染试剂与50+0.5混匀-标记1的稀释转染试剂与50+0.2混匀用枪头小心混匀。勿振荡混匀。将转染试剂：siRNA复合物孵育在+15至+25℃下15-20min。将每管内的复合物全部加至24孔板的孔内（1管对应1孔）。将复合物加至细胞。从培养箱中取出细胞培养板。无需弃去生长培养基。将转染复合物逐滴加至细胞中。轻柔振荡或旋转培养板或培养瓶，确保培养物均匀分布于培养板表面。对于96孔板，建议使用旋转仪低速旋转30秒混匀。将培养板放回培养箱继续培养，直至基因沉默结果分析。X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent：siRNA复合物添加至细胞中后，无需更换新鲜培养基（其他转染试剂可能需要更换成新鲜培养基）。对大部分细胞系的转染，如HeLa，NIH3T3，HEK-293，COS-7等，在含转染复合物的培养基中生长24-72小时，不会影响基因沉默结果。如步骤中细胞在无血清培养基中进行转染，可在转染复合物添加3-8h后更换为含血清培养基。不同规格培养容器中X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent,siRNA和质粒DNA的用量优化不同培养容器中转染条件的建立参见表1。X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent：siRNA的建议比例为5：1，实验初期建议在此比例基础上进行转染试剂和siRNA用量的优化。如需调整比例范围，可在X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent：siRNA的2-10：1的范围内进行进一步的优化。培养容器直径（mm）96孔板24孔板6孔板表面积（cm2）0.41.99细胞接种量[×105]建议起始量0.05-0.20.10.1-0.80.41-42培养基体积（ml）0.150.452.0siRNA用量（μg）建议起始量（μg）稀释体积（μl）0.05-0.30.15150.1-1.00.5（40pmoles）500.4-5.02.0100转染试剂用量（μl）建议起始量（μl）稀释体积（μl）0.1-4.00.8150.5-102.5502-3510100总体积（ml）0.180.552.2表1共转染实验X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent可用于siRNA和质粒DNA的共转染。通常情况下，转染质粒DNA需要的细胞数量要多于转染siRNA需要的细胞数量。对于应用X-tremeGENEsiRNAReagent的共转染实验，请参考以下建议：•提前接种细胞，使细胞在转染时的汇合度达到90%。•如果您已优化siRNA转染的复合物比例，在进行共转时维持同样的转染试剂：总核酸比例。(根据共转时增加的核酸总量[µg],以相应的比例增加转染试剂的用量)。•不同培养容器中共转染条件的建立和优化参见表2。X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent:总核酸的用量比例应至少大于3。培养容器直径（mm）96孔板24孔板6孔板表面积（cm2）0.41.99细胞接种量[×105]建议起始量0.05-0.20.10.1-0.80.41-42培养基体积（ml）0.150.452.0siRNA用量（μg）建议起始量（μg）0.05-0.30.080.1-1.00.250.4-5.01.0DNA用量（μg）0.150.52.0稀释体积（μl）1550100转染试剂用量（μl）建议起始量（μl）稀释体积（μl）0.1-4.00.8150.5-102.5502-3510100总体积（ml）0.180.552.2表23疑难解答疑难现象可能原因建议基因沉默水平低转染效率低转染时细胞密度不佳对于大多数细胞类型来说，在较低密度接种细胞，建议转染时汇合度为30-50%。细胞传代次数太多，或使用了静息期的细胞使用低传代次数、且在生长指数期定期传代的细胞siRNA用量不足优化（增加）siRNA用量。转染试剂用量不足针对各细胞系，均需优化转染试剂和siRNA用量，及细胞培养物中转染复合物的加入量。转染时加入抗生素转染培养基中勿使用抗生素。转染复合物形成不佳使用无血清培养基稀释转染试剂和siRNA。si