DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤

DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH80的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。…一、实验目的学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。三、实验材料实验14提取的DNA样品，四、器具及药品电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。五、实验步骤1、安装电泳槽将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。2、琼脂糖凝胶的制备称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。3、灌胶将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。5、加样将DNA样品与加样缓冲液（loadingbuffer）按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。6、电泳安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。7、染色和观察取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。附：⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。⑵加样缓冲液的配制：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。⑶溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μl的母液，加入250ml的水中，使其终浓度为0.5μg/ml，混合均匀。⑷100倍TE缓冲液的配制：1mol/LTris-HCl（pH8.0），100mmol/LEDTA称取Tris121.1g，EDTA-Na237.23g，先用800ml双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20ml），然后定容至1000ml。⑸100倍电泳缓冲液的配制：4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA称取Tris242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na237.23g，先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50ml），然后定容至500ml。用时稀释100倍。