血红蛋白的提取和分离(经典)

(一）蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物2、组成元素C、H、O、N一、基础知识1、含量3、相对分子质量高分子化合物4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合写出氨基酸脱水缩合形成二肽示意图氨基酸的结合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH氨基酸的结合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH氨基酸的结合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽键脱水缩合氨基酸的结合方式:脱水缩合肽键CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O氨基酸的结合方式:脱水缩合CCHR1NH2COCHR2HNO肽键二肽CHCOOHR3HNH2O肽键三肽•以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。H2O8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9、蛋白质结构的多样性①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成________个肽键,脱去______个水分子，至有氨基和羧基各____个11、相关计算n-mn-mm③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为______________n·a-(n-m)·18血红蛋白思考1高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考2人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。本课题学习目标体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：①样品的处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析。凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等一、基本概念及原理原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示二、缓冲溶液在一定范围内，能够抵制对溶液PH值的影响，维持PH不变。1.作用:2.配制:通常由溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得在使用的缓冲液。3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液外界的酸和碱基本1~2种缓冲剂使用比例不同PH范围内思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3三、电泳---血红蛋白的分离鉴定方法1.概念：带电粒子在作用下发生的过程。2.原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有的基团，在一定的PH下，这些基团会带上或。在电场的作用下，这些带电分子会向着的的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。电场迁移可解离正电负电与其所带电荷相反带电性质的差异大小形状迁移速度最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图迷你双垂直电泳槽等电聚焦多用电泳槽卧式电泳槽电泳槽9（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图（A为正面，B为剖面）1：样品胶pH6.72：浓缩胶pH6.73：分离胶pH8.94：电极缓冲液pH8.310①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶色谱法的原理；(2)电泳法的原理。A二、实验步骤蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（电泳）实验操作样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程红细胞的洗涤粗分离：血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液纯化：纯度鉴定透析—去除样品中分子量较小的杂质用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.血液有哪些成分？1.用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用离心，用洗涤，重复洗涤，直至C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间五倍体积的生理盐水三次上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。初次离心后的结果3次洗涤后的结果（2）释放血红蛋白思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？（使用磁力搅拌器充分搅拌）目的分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作（3）分离血红蛋白溶液：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次柜式离心机2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）（1）用方法进行粗分离，透析袋由半透膜制成，常用。将透析袋放入溶液中进行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是。透析玻璃纸、肠衣、膀胱膜透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质磷酸缓冲透析过程动画演示（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。3、纯化（凝胶色谱）---去除相对分子量较大的杂质蛋白凝胶色谱柱的制作（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。装配好的凝胶柱(3）样品加入与洗脱①加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。②加透析样品步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱5.收集缓冲液凝胶①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：加到色谱柱的（）③样品渗入凝胶床：（）④再调整缓冲液面洗脱：⑤收集：待（）接近色谱柱底端时收集顶端样品完全进凝胶层红色的蛋白质色谱柱制作成功的标志：红色区带均匀一致的移动记4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳•判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。1、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）（1）、胶板的制备：①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干②.把玻璃板在灌胶支架上固定好（2）、分离胶的制备：•按下表制备分离胶(T=12%,pH=8.8)试剂双蒸水分离胶缓冲液丙胶贮液ApTEMED用量1.65mL1.3mL2.0mL0.05mL0.002mL•胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。（3）、浓缩胶的制备：•按下表制备浓缩胶(T=4%,pH=6.8)试剂双蒸水浓缩胶缓冲液丙胶贮液ApTEMED用量1.46mL0.25mL0.27mL0.02mL0.002mL•用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→聚合。（4）、取样取纯化后的血红蛋白样品10μL加入10μL上样buffer（内含少许溴酚蓝的40％蔗糖）混匀。（5）装槽、点样：拔出梳子→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→在电泳槽中加入缓冲液→点样。（6）电泳：（7)、剥胶、染色及脱色凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。(8)、结果1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双