临床输血学检验—HDN

临床输血学检验新生儿溶血病南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院输血科江苏省临床用血质控中心周小玉概念：新生儿溶血病（HaemolyticDiseaseofNewborn，HDN)系指母胎血型不合引起的母亲对新生儿（或胎儿）红细胞发生同种免疫反应引起的溶血性疾病。我国以ABO血型不合造成ABO-HDN比较多见，Rh血型不合造成Rh-HDN比较少见，其他系统血型不合造成HDN更少见。胎儿从父亲遗传来的红细胞抗原恰为母亲所缺少,胎儿红细胞通过胎盘进入母体血循环刺激母体产生相应的血型抗体（IgG）。此抗体又可通过胎盘进入胎儿血循环与胎儿、（新生儿）红细胞相结合，发生特异性抗原抗体反应，使红细胞破坏而发生溶血现象。发病病因：•抗体性质：IgG•多发生于ABO和Rh两个血型系统抗A，抗B，抗D，抗EABOHDNABO新生儿溶血病0型母亲——A型或B型婴儿多为第一胎Rh新生儿溶血病Rh阴性母亲——Rh阳性婴儿很少为第一胎临床特点ABO溶血病Rh溶血病发生频率常见不常见发生的母子血型主要发生在母O型胎儿为A型或B型母缺少任一Rh抗原胎儿却具有该Rh抗原发生胎次第一胎可发病（约半数）一般发生在第二胎；第一胎也可发病下一胎情况不一定大多数更严重临床表现较轻较重，严重者甚至死胎黄疸生后第2～3天出现24小时内出现并迅速加重贫血轻可有严重贫血或伴心力衰竭肝脾大很少发生多有不同程度的肝脾增大晚期贫血很少发生可发生，持续至生后3～6周症状与体症：贫血黄疸水肿肝脾肿大全身表现◆Rh溶血◆ABO溶血胎儿红细胞溶血重心力衰竭髓外造血↑肝脾肿大胎儿全身水肿低蛋白血症胎儿重度贫血胎儿血中胆红素↑新生儿黄疸母亲肝脏胎盘娩出时黄疸不明显新生儿处理胆红素↓血清UCB过高胆红素脑病血脑屏障胎儿红细胞溶血轻实验室检查产前检查产后检查主要检查项目:产前检查:夫妇血型检查(ABO、Rh)抗体筛检血型IgG抗体效价测定连续检查发现效价持续升高，则表明胎儿受害的可能性增大羊水检查：测定羊水胆红素水平，估计胎儿溶血程度B型超声检查：了解胎儿有无水肿。IgG抗体效价测定原理：父母血型预测胎儿的血型，判断HDN发生的可能性IgG是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白，目的检测IgG类性质的抗体（如IgG抗A、抗B、抗D等）排除IgM抗体的干扰（二巯基乙醇或二硫苏糖醇）凝聚胺法抗人球试管法微柱卡法方法试剂选择IgG抗体效价测定IgG抗体效价测定—方法和试剂1、二巯基乙醇（商品化）2、试剂细胞酶法IgG抗体效价测定操作步骤：取10支小试管，编号为1，2…10；另取小试管1只，加入待检血清和2-Me（0.1M）各200ul，置37℃温育10分钟，取出后待用。向第2～10支试管中各加入NS100ul；向第1,2支试管中各加入2-Me处理过的血清(抗D测定除外)100ul,从第2支试管吸取稀释液100ul加入第3管,依次作倍比稀释,保留第10管稀释液备用;向1～9管中各入5%(A、B或O)RBC悬液50ul；用适当的技术来检查（聚凝胺、抗人球、酶法等），肉眼观察结果。主要检查项目：产后检查：新生儿血型鉴定（ABO、Rh）血常规检测：溶血RBC、Hb下降，网织红和有核红升高。生化检查：胆红素升高，以未结合胆红素为主。溶血三项检测：直接抗人球蛋白试验、游离抗体筛查和抗体释放试验。溶血三项—直抗试验：实验原理：检测新生儿红细胞上是否存在免疫性抗体；患者体内若有与红细胞抗原相应的不完全抗体存在，可与红细胞结合。但因不完全抗体分子小，不能有效地连接红细胞，仅能使红细胞处于致敏状态，加入抗球蛋白血清，与红细胞上吸附的不完全抗体结合，在致敏红细胞之间搭桥。抗人球试管法微柱抗人球卡法方法试剂选择直抗试验溶血三项—直抗试验直抗试验溶血三项—直抗试验：操作步骤：将患者红细胞制备成0.8～1.0%RBC悬液（0.5mlLiss+5ul压积RBC)，待用。准确吸取上述制备好的RBC悬液50ul加入微柱凝胶孔中。置孵育器孵育15分钟。离心10分钟后观察结果。结果判定：阴性：红细胞完全沉于底部。阳性：红细胞不同程度地分散于凝胶柱中。临床意义：观察患儿RBC有无被免疫抗体致敏,一旦发现新生儿红细胞直抗阳性，即成为诊断新生儿溶血病有力证据。溶血三项—直抗试验：注意事项：由于新生儿A(B)抗原密度比成人低,结合在红细胞上抗体往往较少,ABOHDN患儿直抗试验常常得到阴性或弱阳性（≤1+）结果。RhHDN为常为强阳性(≥2+)。是区别ABO和RhHDN主要标志。基于上述原因，应注意：对于微弱的凝集，也应报告结果（可报弱阳性）ABOHDN既使直抗和游离试验均为阴性，第三项放散实验必须要进行。。溶血三项－游离抗体实验原理：用间接coombs试验检测新生儿血清中的血型抗体,如果检出的抗体能够和新生儿红细胞反应,则新生儿可能患溶血症。溶血三项－游离抗体操作步骤：将50ul浓度为0.8～1.0%标准的A（B）、O细胞分别加入已标注的微柱凝胶孔中。向各孔中分别加入患儿的血清25ul。置孵育器孵育15分钟。离心10分钟后观察结果。37℃孵育15′1030r/min,10′观察结果溶血三项－游离抗体结果判定：阴性：红细胞完全沉于底部。阳性：红细胞不同程度地分散于凝胶柱中。临床意义：游离试验是检测新生儿血清中的血型抗体，具体分析见下表：溶血三项－游离抗体新生儿血清中游离抗体检查与指示细胞反应结果判定AcBcOc+－－有游离的抗-A抗体－+－有游离的抗-Ｂ抗体++－有游离的抗-A,抗-B或抗-A,B抗体+/－+/－+有游离的ABO系统以外的抗体－－－无游离的抗体注意事项:检出游离抗体的类型必须与红细胞上表达的抗原相对应才具有意义。例如在A型新生儿血清中检测出IgG抗A，则该新生儿游离试验阳性。所以患儿为Ａ型测Ａ、Ｏ两孔，Ｂ型检测Ｂ、Ｏ两孔，Ｏ型检测Ｏ一孔即可。实验所用的反应谱细胞应包含尽可能多的血型抗原,以便检出少见的血型抗体。注意事项：Ｒh溶血病游离试验最好用母亲的血清代替婴儿血清与反应细胞反应。由于婴儿体内的所有血型抗体都来自母亲，而且母亲血清中的抗体效价比婴儿血清中的抗体更高，可以得到更清楚的结果。本实验为非确诊实验，需结合另外两项综合分析，对于观察换血疗效效果较好。溶血三项－释放试验实验原理检测新生儿红细胞上的致敏的血型抗体。用特殊的方法将致敏在新生儿红细胞上的抗体释放下来，然后再检测放散液中的抗体。抗体放散(释放试验)实验原理检测新生儿红细胞上的致敏的血型抗体。用特殊的方法将致敏在新生儿红细胞上的抗体释放下来，然后再检测放散液中的抗体。抗体放散热放散适用于ABO系统的HDN乙醚放散适用于Rh系统的HDN溶血三项－热放散操作步骤：用NS充分洗涤1ml患儿红细胞３～４次，保留最后一次洗液。向压积红细胞中加入1ml生理盐水，混匀。将上述细胞放入56℃热水中水浴10min，每隔15～30s摇动混匀一次。取出后置盛有56℃热水的离心管中，立即以2000r/min离心３分钟，离心后立即将上层放散液转移到另一试管中。放散液分别与A、B、O反应细胞做间接COOMBS，同时将最后一次的洗涤液做平行对照。溶血三项－乙醚放散操作步骤：用NS充分洗涤1ml患儿红细胞３～４次，保留最后一次洗液。向压积红细胞中加入2ml分析纯乙醚。塞上塞子，颠倒混匀1min,然后1300r/min离心5分钟。离心后分为三层，上层为乙醚，中层为红细胞基质，下层是具有抗体的放散液，为深红色。用干净的吸管吸出放散液，若有混浊可再离心一次。将放散液置于37℃水浴30min,除尽乙醚,离心上清即为放散液.放散液分别与A、B、O反应细胞做间接COOMBS，同时将最后一次的洗涤液做平行对照放散液RBC层两种放散示意图热放散乙醚放散乙醚层放散液RBC层溶血三项－抗体放散结果判定：阴性：红细胞完全沉于底部。阳性：红细胞不同程度地分散于凝胶柱中。临床意义：用于检测新生儿红细胞上致敏的血型抗体,释放试验敏感度高,是“三项实验”中敏感度最高的一项实验,也是判定新生儿溶血病“最有力的证据”。属于确证实验。溶血三项－抗体放散新生儿血清中抗体释放试验与指示细胞反应结果判定AcBcOc+－－释放出IgG抗-A抗体－+－释放出IgG抗-B抗体++－释放出IgG抗-A,抗-B或抗-A,B抗体－－－未释放出抗体+++释放出ABO血型系统以外的抗体治疗产前治疗血浆置换宫内输血酶诱导剂提前分娩新生儿治疗光疗药物治疗换血疗法其他治疗产前治疗血浆置换目的：换出抗体，减少胎儿溶血用于：血型抗体效价明显增高，又不宜提前分娩的孕妇宫内输血目的：纠正贫血方法：直接将与孕妇血清不凝集的浓缩红细胞在B超下注入脐血管或胎儿腹腔内用于：胎儿水肿或胎儿Hb＜80g/L，肺尚未成熟者。产前治疗酶诱导剂孕妇于预产期前1～2周口服苯巴比妥目的：诱导胎儿UDPGT（葡萄糖醛酸基转移酶）产生增加，减轻新生儿黄疸。提前分娩适用于既往有输血、死胎、流产和分娩史的Rh阴性孕妇；本次妊娠Rh抗体效价逐渐升至1:32或1:64以上；用分光光度计测定羊水胆红素增高；羊水卵磷脂/鞘磷脂（L/S）＞2，提示胎肺已成熟。新生儿治疗光疗降低血清未结合胆红素简单而有效的方法，原理：使非结合胆红素由非溶解型转变成水溶解型，能够快速地通过胆汁和尿液排出体外。药物治疗黄疸茵，白蛋白，苯巴比妥等新生儿治疗-换血疗法血液选择原则：ABOHDN：选择O型红细胞+AB型血浆。RhHDN：选择Rh系统与母亲同型、ABO系统与患儿同型血液+AB型浆。选择RH(D)阴性O型洗涤红+AB型血浆注意:由于新生儿肝肾发育不健全，使用贮存期长的血容易引起高钾血症,所以尽可能使用保存期短的新鲜血(5d)。新生儿治疗-换血疗法配血原则主侧：一般采用患儿母亲的血清作“主侧”交叉配血。原因：1.患儿发生溶血的抗体来自母亲2.患儿出生后，抗体含量总低于母亲血清中抗体的含量，这时患儿尚未产生抗体，所以供血者RBC与母亲血清配合时，也一定与患儿血清配合。如果当时只有患儿的血样：可采用患儿RBC放散液作“主侧”配血。原因：进入患儿体内的抗体已大部分被患儿RBC吸附，所以放散液要比患儿血清更具有代表性。新生儿治疗-换血疗法换血量原则：一般150～180ml/kg体重，可换出约70%～85%的致敏红细胞及胆红素。