分子标记

分子标记MolecularMarker遗传标记遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。1.形态标记形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。2.细胞学标记细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。3.蛋白质标记同工酶是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶，其结构的差异来源于基因类型的差异，因此并不一定是同一基因的产物。每一个酶的不同电泳酶谱表现型可能是由于不同的基因座引起的，也可能是同一基因座上的不同的等位基因引起的。为了易于区别，又将后一类同工酶称为等位酶。4.DNA标记DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。DNA标记已广泛应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等各个方面。广义的分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。DNA标记DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，哪怕是单个核苷酸的变异。依据对DNA多态性的检测手段，DNA标记可分为四大类：第一类为基于DNA-DNA杂交的DNA标记。该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的RFLP标记。第二类为基于PCR的DNA标记。这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。随机引物PCR标记包括RAPD标记、ISSR标记等，其中RAPD标记使用较为广泛。特异引物PCR标记包括SSR标记、STS标记等，其中SSR标记已广泛地应用于遗传图谱构建、基因定位等领域。第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。这类DNA标记可分为二种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记。另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS标记。第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。DNA标记多态性分子基础示意图分子标记的类型①基于杂交的分子标记，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,即限制性长度片段多态性）。②基于DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性）。③基于PCR的分子标记，它又分为两类：RAPD（RandomamplifiedpolymorphismicDNA）DAF（DNAamplificationfingerprinting）SSCP（Singlestrandconformationalpolymorphism）小卫星DNA（MinisatelliteDNA）微卫星DNA（MicrosatelliteDNA）,又称SSR（Simplesequencerepeats）ISSR（Inter-simplesequencerepeat）AP-PCR（ArbitraryprimerPCR）它主要有SCAR（Sequencecharacterizedamplifiedregion）STS(Sequencetaggedsite)位点特异的PCR标记方法多位点标记方法基于PCR技术的DNA扩增方法AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增CAPS（Cleavedamplifiedpolymorphicsequence）CAPS是先扩增，再酶切扩增片段又称PCR-RFLPPCR与酶切相结合的方法RFLPVNTRRAPDISSRSSRAFLP基因组分布低拷贝编码序列整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组遗传特点共显性共显性多数显性显性/共显性共显性显性/共显性多态性中等较高较高较高高较高检测基因座位数1-310-1001-101-10多数为120-200探针/引物类型gDNA或cDNA特异性低拷贝探针DNA短片段9-10bp随机引物16-18bp特异引物14-16bp特异引物16-20bp特异引物DNA质量要求高高低低中等高DNA用量2-10μg5-10μg10-25ng25-50ng25-50ng2-5μg技术难度高中等低低低中等同位素使用情况通常用通常用不用不用可不用通常用可靠性高高低/中等高高高耗时多多少少少中成本高高较低较低中等较高主要类型的DNA分子标记的技术特点比较一、RFLP标记技术RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)即限制性片段长度多态性。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子的酶。这些特定碱基组成的DNA序列叫做相应内切酶的识别位点或限制性位点，长度一般在4至8个碱基对之间。如PstⅠ的限制性位点是（其中箭头表示被切开的位置）：5’CTGCA↓G3’3’G↑ACGTC5’通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点。因此，限制性内切酶能将很长的DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA分子上限制性酶切位点的分布。特定的DNA／限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它能作为某一DNA（或含有该DNA的生物）的特有“指纹”，这种“指纹”在DNA分子水平上直接反映了生物的遗传多态性。如果某一个限制性位点发生了突变，这个限制性内切酶将不再识别这个位点，不再进行酶切反应，产生片段的大小将由最邻近的限制性酶切位点决定。基于DNA-DNA杂交的DNA标记RFLPRLFPrestrictionfragmentlengthpolymorphism原理限制性内切酶消化获得的DNA片段大小的变异780bp470bp310bp基因组很大时，某种限制性内切酶的酶切位点很多，经酶解后会产生大量大小不一的限制性片段，这些片段经电泳分离形成的电泳谱带是连续分布的，很难辨别出某一限制性片段大小的变化，必须利用单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆作为探针，通过Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分析。RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力的过程。RFLP标记多态性的分子基础SouthernblottingRFLP实验流程提取DNA酶切反应电泳转移自显影RFLP图谱RFLP显性标记or共显性标记RFLP的应用：1.分类及遗传多样性研究2.遗传图谱的建立遗传图谱(geneticmap)指某一物种的染色体图谱(即连锁图谱)，显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置，而不是在每条染色体上特殊的物理位置。3.基因定位基因定位：确定基因在染色体上的相对位置和排列次序。二、VNTR标记技术许多生物体的DNA存在含有大量的串联重复序列的高变异区。通常将以15～75个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星（Minisatellites），以2～6个核苷酸为基本单元的简单串联重复序列称为微卫星（Microsatellites）或简单序列重复（SSR）。小卫星和微卫星也常常称作重复数可变串联重复（VNTR）(variablenumberoftandemrepeats)标记。VNTR标记产生的多态性是由同一座位上的串联单元数量的不同而产生的。利用VNTR标记可进行分子定位和作图的研究工作。VNTR变异的原理示意图A、B、C分别表示不同基因型基于PCR技术的DNA标记一、RAPD标记随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphismicDNA,RAPD)标记所用的引物长度通常为9～10个碱基，大约只有常规的PCR引物长度的一半。使用这么短的PCR引物是为了提高揭示DNA多态性的能力。由于引物较短，所以在PCR中必须使用较低的退火（DNA复性）温度，以保证引物能与模板DNA结合。RAPD引物已经商品化，可以向有关供应商直接购买，不需要自己合成。商品化的RAPD引物基本能覆盖整个基因组，检测的多态性远远高于RFLP。RAPD标记的优点是，对DNA需要量极少，对DNA质量要求不高，操作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组。在RAPD标记分析中，通常每次PCR反应只使用一种引物。在这种情况下，只有两端同时具有某种PCR引物结合位点的DNA区段才能被扩增出来。如果将2种引物组合使用，则还可扩增出两端分别具有其中一种引物的结合位点的DNA区段，产生新的带型，找到更多的DNA分子标记。RAPD标记的不足之处是，一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提供的信息量不完整。另外，由于使用了较短的引物，RAPD标记的PCR易受实验条件的影响，结果的重复性较差。不过，只要扩增到的RAPD片段不是重复序列，则可将其从凝胶上回收并克隆，转化为RFLP和SCAR标记，以进一步验证RAPD分析的结果。随机引物PCR产物多态性的分子基础类型1为显性标记，是最常见的多态性，类型2、3、4为共显性标记，但较少见0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb×0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系2RAPD的基本实验程序1.DNA的提取（1）碱法（2）CTAB法（3）SDS法2.模板DNA浓度和质量的检测3.PCR扩增4.电泳检测：PCR结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲液，每个泳道点样20ul。5.将凝胶浸于1ug/ml的EB中30min~60min，用水清洗约10min，观察、拍照。6.统计分析：记录条带清晰的RAPD条带，计算带纹相似率；计算带频率、群内遗传纯度；计算DNA片段大小。RAPD图谱引物S1398扩增图谱(RAPDprofileofprimerS1398)A.1～4.贺氏竹蝗C.hoffmanniUvrov5～12.黑翅竹蝗C.fasciatafasciataB.1～6.宽翅曲背蝗P.micropterameridionalis7～12.隆额网翅蝗A.coreanaShirakiM.分子量标准(Molecularmarker):200bpDNALadderAB网翅蝗科四种蝗虫的RAPD多态性研究数据分析某一片段在一个个体中存在时记为1，否则为0。按照Nei’s和Li的公式：S＝2Nxy/(Nx+Ny)D=1-S式中，S为带纹相似系数，Nxy为x和y的共有片段数，Nx和Ny分别为x和y中出现的片段数，D为遗传距离。用Mega或NTsys软件的UPGMA和NJ法对所有个体聚类分析，构建分子系统树。数据分析多态位点比率P：扩增的DNA片段出现频率小于0.99的位点为多态性位点多态性位点比率P＝具有多态的位点数/检测到的位点数（k:RAPD条带数，Pi:第i条带在该种群出现的频率，H：为每条引物的种群RAPD多样性）Shannon信息指数：Shannon信息指数是度量物种多样性的最常