SBF在预测骨修复材料体内生物活性中的作用

SBF在预测骨修复材料体内生物活性中的作用？骨修复材料的骨粘连能力，经常通过其表面在SBF溶液中形成磷灰石的能力大小来评价。然而，这个方法并没有经过系统地测评，其是否有效还不能确定。这里我们回顾了SBF发展的历史，对多种骨修复材料表面在SBF溶液中形成磷灰石能力强弱与其在生物体内真正的活性大小做了比较，还列举了几例依据上述观点开发而出的新颖骨修复材料。本论文结论是材料表面在SBF中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，此评价材料生物活性方法的应用可以减少实验所需动物数量，同时增加动物实验的可持续时间。附件A.SBF的制备方法及其磷灰石形成能力检测步骤A.1.模拟体液的配备A.1.1.配备SBF所需试剂所需试剂列出如下：（所有试剂必须保存在干燥器中，配备SBF过程使用离子交换蒸馏水）氯化钠（NaCl）碳酸氢钠（NaHCO3）氯化钾（KCl）三水.磷酸氢二钾（K2HPO4.3H2O）六水.氯化镁（MgCl2.6H2O）氯化钙（CaCl2）硫酸钠（Na2SO4）三羟甲基胺烷（（HOCH2）3CNH2），Tris1M-盐酸，1M-HClpH标准溶液（pH4,7,9）。A.1.2.SBF溶液离子浓度表A1列出SBF溶液中离子浓度A.1.3.SBF的配备步骤由于SBF溶液对于磷灰石过饱和，所以配备方法不恰当会导致溶液中磷灰石沉淀产生。整个配备过程需要确保溶液无色、透明，容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液，洗净仪器重新配制。准备一个1000ml的塑料烧杯。首先于塑料烧杯中装好700ml离子交换蒸馏水、一个适当大小磁子，杯口密封以蒸发皿或塑料薄膜。搅拌并调节水温至36.5+-1.5C。按表A2所列顺序在36.5C恒温下逐个溶解第一到第八个化合物，溶解过程注意以下事项：(a)配备SBF溶液不能用玻璃容器，必须是塑料容器且不能有划痕，因为磷灰石会在玻璃容器表面或塑料容器的划痕上成核析出。(b)千万不能同时溶解几个试剂。下一个化合物必须在前一化合物完全溶解之后加入。(c)由于氯化钙经常以小颗粒形式存在，而小颗粒的溶解需要相对较长时间，且氯化钙对磷灰石成核有很大影响，所以溶解氯化钙需要较长时间，保证它溶解完全之后，再溶解下一化合物。(d)量筒量取盐酸溶液之前要润洗。(e)称量吸湿性试剂动作要尽量快。比如KCl，K2HPO4.3H2O，MgCl.6H2O，CaCl2，Na2SO4。最后两个pH调节试剂需按以下方法溶解：溶液温度恒定在36.5+-1.5C。加离子交换蒸馏水至总溶液900ml。将pH计电极插入溶液，Tris溶解之前溶液的pH应该是2.0+-1.0。溶液温度应该在35-38C之间，最好是36.5+-0.5C。缓慢地小份小份溶解Tris，同时注意pH变化。溶解方法是加入少量Tris，待其溶解完全pH值稳定，再加少量Tris…，如此重复，溶液pH逐渐升高。当pH值上升到7.30+-0.05时，调节溶液温度保持在36.5+-0.5C。继续加入Tris将pH调至接近7.45。笔记1：溶解Tris时一次加入量不能过大，否则溶液中局部pH值剧烈增加，导致磷酸钙沉淀产生。在加Tris调节pH至7.30+-0.05过程中，如果溶液温度不是36.5+-0.5C，停止加入Tris，待温度调成36.5+-0.5C之后，再继续加入Tris调pH。笔记2：考虑到pH值随溶液温度降低而升高（在此温度是pH降速0.05/C），温度为36.5+-0.5C时pH值不能超过7.45。pH上升到7.45+-0.01时，停止溶解Tris，移液枪滴加1M盐将pH酸调低至7.42+-0.01，注意确保pH不要低于7.40。交替加入Tris和盐酸保证pH在7.42-7.45中，至Tris加完。调节溶液温度至36.5+-0.2C。最终缓慢加入盐酸调节pH为7.40移去pH计电极，离子交换蒸馏水润洗并将洗液收入所配SBF溶液中。将配好的SBF转移入1000ml容量瓶，粗略定容（溶液温度降低，体积会减小，所以待溶液温度降至20C时，再准确定容）。烧杯盖上盖子并用塑料薄膜封好。A.1.4.确认SBF离子浓度SBF溶液离子浓度如表A1。化学分析法确定SBF离子浓度。笔记：在配好的SBF溶液中，评测标准玻璃表面磷酸钙的形成能力。标准玻璃的化学组成如表A3。将标准玻璃A-C浸入SBF12,24和120h后，薄膜X散射或SEM都可以检测到有磷灰石膜生成。A.1.5.配备好的SBF盛在塑料瓶中，盖紧盖子于5-10C冰箱中保存。新配SBF有效期为30d。A.2.磷灰石形成能力测试A.2.1.对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积精确到2mm2应用如下公式计算出SBF用量：Vs=Sa/10,(1)Vs（ml）是SBF的体积量，Sa（mm2）表示样品的表面积。对于多孔材料，SBF的用量应大于上式计算量准备好塑料瓶或烧杯，装入计算出的SBF体积量加热到36.5C，然后按示意图往里放置样品。笔记：样品在容器中放置有两种情况，如图A1(a)，A1(b)。少数情况下，SBF溶液会生成同质磷灰石沉积于样品表面。所以如果样品放置是图A1(b)种情况，表征实验应该检测样品的下表面。四个星期内，分别取出恒温浸透不同时长的各组样品，纯水轻盈洗净。然后将样品放入干燥器中常温干燥。笔记1：对于骨粘连材料，表面一般在四个星期内生成磷灰石。笔记2：样品一旦从SBF溶液中取出，就不能再浸入SBF继续试验。A.2.2.表面表征用TF-XRD或SEM对样品进行表征笔记1：TF-XRD测试在3-50度角2theta范围以2度/min的速度扫描，CuKa(^=0.15405nm)作为放射源，1度角应对样品表面的意外光束。笔记2：SEM的干燥样品应该喷金属膜以增加导电性。高倍、低倍都得拍下SEM照片笔记3：SEM能观察到样品表面的形貌，而不能判断表面沉积物是否就是磷灰石，TF-XRD可以明确判定新生物质是否磷灰石。但是，沉积形成的磷灰石颗粒和膜有其特殊的性质，使用SEM即可辨别出，所以有时也可以只用SEM对样品进行表征。