凝胶迁移或电泳迁移率实验

凝胶迁移或电泳迁移率EMSA实验一：介绍凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。【晶莱生物】二：实验步骤1.探针的标记探针为含有与蛋白特异结合的中心盒，大约20bp左右，使用pierce公司的3’末端标记试剂盒(PIERCE，Rockford，IL，USA)标记。操作步骤参照说明书，具体步骤如下：1)将试剂盒中除TdT以外的其他组分解冻并置于冰上。迅速稀释TdT：SxTdTReactionBuffer2u1，超纯水7ul20U/ulTdT1ul。稀释后得到1XdilutedTdT(2U/ul)，稀释后的TdT必须现配现用，稀释后不能保存。2)反应体系：5xTdTbuffer10ul，DNA5pmol，Biotin-ll-UTP5ul，dilutedTdT5ul，超纯水补足50ul。在37℃温浴30min，加入2/5体积0.2MEDTA，终止反应。加入等体积氯0仿：异戊醇(24：1)抽提TdT，涡悬充分，高速离心3min，取上层即为标记探针，分装后-80℃保存。2.非变性电泳1)非变性电泳：30%丙稀酸胺2.66ml，TBE(5X)2ml，10%过硫酸按1.4ml，TEMED7ul，双蒸水补足20ml。按照上述配方配置4%的非变性胶。在烧杯中迅速混匀，置于冰上，灌胶，待凝胶聚合后拔出梳子，用双蒸水洗点样孔，再用0.5xTBE清洗点样孔。2)样品准备：按照不同的组合加入DNA和蛋白，另外还需要加入结合缓冲液，如果是粗蛋白还需要加入poly(dI.dC)(试剂盒中有)抑制非特异性条带的产生。3)电泳：预跑胶30-60min，100V。上样。跑胶，100V，30min左右。注意电泳要在冰上完成，以防止电泳时产生热量使不稳定的复合物解离。4)转膜：电泳跑好后，将胶取下，放在大小相似的尼龙膜上，上下各加一层润湿的blottingpaper，放到半干转移装置上，100V，380mA，转膜1h。5)UV交联：取出膜。在紫外交联仪中999.9mJ，固定10min。6)洗膜：a.将BlockingBuffer和4XWashBuffer置于37-50℃使其溶解。b.用20mlofBlockingBuffer封闭膜，温浴15min，摇床轻摇。c.在20mlBlockingBuffer中加入66.7ulStabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate(1：300稀释)，配置成conjugate/blockingsolution。d.将膜从blockingbuffer中取出，在conjugate/blockingsolution中轻摇15min。e.将4XWashBuffer用双蒸水稀释成1Xwashsolution。f.将膜置于新的培养皿，用20ml1Xwashsolution冲洗。g.用1Xwashsolution洗膜4次，每次5min，摇床轻摇。h.在新培养皿中加入30mlSubstrateEquilibrationBuffer，将膜放入，温浴5min，摇床轻摇。i.将6mlLuminol/EnhancerSolution和6mlStablePeroxideSolution避光置于锡箔纸包好的烧杯中，摇匀，作为SubstrateWorkingSolution。j.将膜从SubstrateEquilibrationBuffer中取出，用滤纸尽量吸去液体，放入新的培养皿。k.将SubstrateWorkingSolution用枪慢慢加到膜上使液体尽量到达整张膜，静置5min。l.取出膜，控制膜不能干燥。m.用保鲜膜将膜包好，不能有气泡。n.在暗室中，将膜放入曝光盒，用X-ray胶片压片，曝光时间随温度变化而不同，室温一般1min。然后将胶片取出，经过显影，水洗和定影可以看到实验结果，如果胶片长期保存一定要在水龙头底下长时间冲洗，晾干后可拍照。客户提供：1、客户提供组织、细胞，公司提取核蛋白并进行蛋白浓度测定；2、客户提供核蛋白，公司进行蛋白浓度测定；3、客户提供已知浓度的核蛋白，公司进行EMSA实验。我们将为您提供：样品质检报告、实验数据分析、实验方法及样品EMSA电泳图。