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荧光定量PCR仪器简介湖南圣湘生物科技有限公司刘昳主要内容荧光定量PCR仪的概述PCR仪的硬件介绍各款PCR仪的介绍荧光定量PCR仪的概述94℃—57℃—72℃水浴锅PCR荧光定量PCR金属浴锅PCR1、PCR仪的发展历史2、荧光定量PCR仪的发展历史Perkin-ElmerCetus仪器公司推出第一台热循环仪ABIPrism7700第一个高通量的实时荧光PCR仪Bio-RadiCycler2000年后更多质优价廉的仪器进入市场，通量更高1985.111996年1998年1999年2000年ABI推出7900HT荧光定量PCR仪Roche推出第一台全自动荧光定量PCR仪Lightcycler1.03、荧光定量PCR仪的组成一台PCR仪主要由控温系统和光源系统两大组件构成。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。通过仪的热循环系统的升降温变化，使得核酸片段得以复制，仪器光学系统采集伴随核酸扩增产生的荧光信号，并对荧光信号进行分析转化、数学运算后，得到扩增曲线。4、荧光定量PCR仪的原理Taqman探针4、荧光定量PCR仪的原理5、荧光定量PCR仪的应用基础科学研究疾病检测与治疗检测、预后优生优育及遗传筛查基因表达分析临床医学应用肿瘤分型/耐药性评估食品卫生检疫及安全评估医院检验科、感染病科等疾控中心血站、血液中心研究所等机构食品监督管理局海关进出口检疫高端市场份额被国外厂商所占领，尤其是在科研，CDC和血站等系统，国外厂商更是处于垄断地位，主要有ABI、Roche、MJ、Bio-Rad、Stratagene、Corbott、Cepheid等国内企业多集中在中低端市场，如上海宏石、西安天隆、达安基因、杭州博日等品牌。高端市场低端市场5、荧光定量PCR仪的市场情况高通量高速度自动化灵活化43218大系列互联网化56、荧光定量PCR仪的发展趋势PCR仪的硬件介绍1、硬件组成光学系统：激发光源和检测系统；热循环系统：加热和制冷系统；信号处理系统；2、激发光源比较卤素灯激光（氩离子）LED(发光二极管）Xenonlamp（氙灯）优点发射光谱宽（全光谱）且连续；光源强，且激发光强度与大多数荧光的强度相似。光源强度大，光透性好。冷光源，无需预热，且使用寿命长；成本低，技术成熟。利用氙气放电发光，光源强度大；发射光谱范围宽适合多种荧光染料的应用。缺点热光源，预热耗时，而且寿命短（约2000h)。发射光谱范围窄；成本高；产热，耗电，寿命短。亮度稍低，发射光谱范围窄且不连续；荧光素的选择有限，固定激发波长；和卤素灯相比光强弱。成本比卤钨灯稍高；发射光谱不宽（430-630nm）应用仪器ABI7000,7300,7500;PE5700;i-cycler,Mx3000p…ABIPrism7900,7700…RocheLC1.5,2.0ABIstepone/plusBio-RadMJOpticon2Da7600;Fluocycle;Slan8.0…RocheLC480…•Laser:高强度,波长范围窄•Tungstenlamp:中等光强,波长范围宽•Lightemittingdiode:低的光强，波长范围窄HalogenLamp2.激发光源比较激光的激发范围(488-514nm)石英卤钨灯激发范围(350-750nm)Excitationcurves050100150200250300350400300320340360380400420440460480500520540560580600620640660680700720Wavelength(nm)Fluorescence(au)ALEXA350FAMTETJOECy3HEXTAMRAROXTexasRedCy52.激发光源比较光电倍增管(PMT)电荷耦合装置（CCD）光电二极管(PDT)优点信噪比高；背景噪音信号低；对较低的光信号敏感度高；检测范围宽。同时对正版进行拍照成像；在同一循环中可对版面照多张照片。成本很低；设备体积小。缺点成本较高；边缘效应；灵敏度比PMT差。信噪比低；灵敏度不好。应用仪器RocheLC1.5and2.0;Bio-Rad,MJ-opticon2;Stratagene系列；Line-GeneFQD33A，slan8.0…ABI系列；RocheLC480;Bio-Rad,i-cycler…ABIStepOneandStepOneplus;Da7600;Fluocycler…3、检测装置比较3、检测装置灵敏度比较SensitivityPMT可以检测到很宽的波长范围，并对信号有放大作用CCD检测范围宽,易受背景信号噪音影响,整体检测时间较长光电二极管可以检测到很宽的波长范围,检测灵敏度低冷CCD装置与普通CCD相比：冷CCD能降低图像噪音，提高图像质量和灵敏度。3、检测装置PMT和CCD检测原理比较：hve-hv•光信号得以扩增.•获得更大的检测信号和更高的灵敏度•无边缘效应•光子释放出电子，使检测器留下一个带正电荷•正电荷记数作为检测信号•信号没有得以放大•有边缘效应4、加热系统：空气加热速度快；管间温度均一性好；无需金属的精密加工；成本低；对环境温度要求高：不能低于室温（15-35℃）;灵活性差：不能做温度梯度；样本数量少（罗氏毛细管32个）。金属热块的加热和降温分别通过电阻丝和半导体来控制。特点：温控范围大（4℃to99℃），均一性（＜±0.5℃）；灵活性好：可以做温度梯度；样本数量多（96孔和384孔)；但其加热速度比空气加热稍慢。4、加热系统：半导体加热系统风扇制冷压缩机制冷半导体制冷优点价格低制冷快；精确性好控温性能强；可低于室温；体积小；可主动制冷。缺点精确度差；不能主动制冷体积大；控温易过头（尤其在制冷时）；破坏臭氧层；技术要求高风扇制冷压缩机制冷半导体制冷5、制冷系统6、荧光定量PCR仪的性能目标通量大通道多灵敏度高线性范围宽反应体积大运行速度快各款PCR仪的介绍PCR仪的家族成员进口•美国应用生物系统公司（ABI）•美国伯乐（Bio-rad）•瑞士罗氏（Roche）•美国安捷伦（Agilent）•德国凯杰（Qiagen）•德国艾本德（Eppendorf）•韩国柏业（Bioneer）国产•杭州博日（Bioer）•上海宏石（Slan）•西安天隆（Tianlong）•上海枫岭（Funglyn）•厦门安普利（Amplly）•广州达安（DA）•上海科华（Fluocycler）2007年：ABIStepone/Plus2010年：ABIViiA7ABI仪器光学路径Rox：(5-carboxy-x-rhodamine)5-羧基-X-罗丹明样本1样本2Rox的功能：1）校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变；2）为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受PCR反应影响；3）均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异；4）均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复Ct值。ABI仪器：校正染料ROXABI仪器：校正染料ROX的效果730075007500fastStep-oneStep-oneplus循环系统Peltier-basedsystem模块96-well96-well96-well(fast)48-well96-well升降温速率+/-1.1℃/s+/-1.6℃/sFast-mode:+/-3.5℃/sFast-mode:+/-2.2℃/sFast-mode:+/-2.2℃/s温度精确度+/-0.25℃+/-0.25℃+/-0.5℃+/-0.25℃+/-0.25℃光学系统卤钨灯，单色激发，4色检测，CCD卤钨灯，5色激发，5色检测，CCD卤钨灯，5色激发，5色检测，CCDLED灯，光电二极管，4色检测蓝LED灯，光电二极管,4色检测运行时间＜2h＜2hFast-mode：~30minFast-mode:＜40minFast-mode:＜40min参比荧光ROXoranycalibrateddyes样本容量20-100ul(0.2ml)20-100ul(0.2ml)10-30ul(0.1ml)10-30ul(0.1ml,平盖，单管，8联）10-30ul(0.1ml,平盖，单管，8联）各款ABI主流荧光定量PCR的特点罗氏定量PCR仪大家族Lightcycler1.5Lightcycler2.0Lightcycler480LightcyclernanoLightcycler1536罗氏CobasAmpliprep空气后通过加热元件加热，热空气经过风扇的作用进入循环腔内；通过风扇的调节来保证空气循环和温度的均一性；加热时，风扇低速运转从而使得腔内的温度均匀；冷却时，风扇高速运转使加热枪和毛细管降温。RocheLC1.5/2.0荧光定量仪特点RocheLC1.5/LC2.0性能参数RocheLC1.5RocheLC2.0激发光源（通道）LED(单通道，470nm±10)LED(单通道，470nm±10)检测元件（检测波长）PMT(540,640,710)PMT(530,555,610,640,670,710nm±20nm)室温要求/温度范围15℃-35℃/40℃-98℃样本容量32×（10-20ul）32×(20ul，100ul)检测通道模式F1:SYBRGreenI;F2：LCRed640;F3:LCRed705RocheLC480热循环系统组成和特点：1.ThermalBlockCycler包括了样本底座（96孔或384孔），Peltier元件，配合Therma-BaseTM热均衡器，银质散热块和电子元件。2.Blockcyclercover(热盖）3.Multiwellplateloader,Multiwellplatedetector,Multiwellplatebar-codescanner(条形码扫描装置），BlockCyclerdoorwithfans.热盖微孔板模块Peltier半导体加热单位冷却装置Therma-BaseTMRocheLC480RocheLC480特有的温控元件Therma-BaseTherma-Base是一种热均衡器。•封闭的真空夹层，内壁为灯芯式结构，存贮工作液；•通过一系列的蒸发和凝结过程来调节控制温度提升导热效率，提高孔间温度均一性，孔间温度的精确度±0.1C快速冷却和加热速度Heating:(4.8)°C/sCooling:(2.5)°C/s整个板的精确PCR结果96孔模式1hour384孔模式40min多孔板座Peltier元件冷却装置：银质散热鳍Therma-Base层光源：Xenon-lampLiquidlightguide(液芯光导向器)RocheLC480光学系统组成及特点激发和发射滤镜轮：5个激发波长和6个检测波长；半峰带分别为25-40nm和20nm；氙灯：激发波长从330nm到630nm；需预热两分钟；平均寿命至少500个小时；易更换。冷CCD(1204x1344),温度被控制在10℃左右，降低了热噪作用。RocheLC480光学系统特点光路特点：如何解决边缘效应？光源太近：光强度够了，但边缘光信号根本无法收集；光源太远：整体光强度不够，且边缘信号弱。RocheLC480独有的compactinstrument:两个解决办法：1.Fieldlens:具有很好的光透性和光收集能力；使得激发和检测光的保持良好均一性；光线以近乎直角的角度经过热盖孔射到每个孔中；2.特殊的光路设计使样本与CCD达到最佳光程位置，光经过多次折射后到达检测系统。•孔间无阴影效应•很好地收集孔边缘光，不会造成边缘光的失真或变化保证了整板的均一性和灵敏度MyIQ单色PCRBio-radIQ5Bio-radICyclerMJOpticon2Bio-radCFX-96伯乐定量PCR仪大家族Bio-RadRealTimePCR仪性能特点安捷