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罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（Insitucelldeathdetectionkit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT10×、荧光素标记的dUTP1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5µl20×DAB＋1μL30％H2O2＋94µlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl,pH7.4-8）或细胞通透液（0.1%TritonX-100in0.1%sodiumcitrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH7.5,10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。三、实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤：1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；3.PBS漂洗2次；4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；5.PBS漂洗2次；6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μlTdT＋450μl荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μlDNase1，反应在15～25℃×10min，后面步骤同处理组。7.玻片干后，加50μlTUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。8.PBS漂洗3次；9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm）；10.玻片干后加50μlconverter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。11.PBS漂洗3次；12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min；13.PBS漂洗3次；14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200～500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）四、注意事项1.进行PBS清洗时，每次清洗5min。2.PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4.TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6.用甲基绿（MethylGreen）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇)、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80～90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7.荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8.试剂保存；未打开的试剂盒贮存在－20℃（－15～25℃）；converter-POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2～8℃）下，至少在6m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。9.结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。