☆临床PCR实验室的设计及管理体系的建立

临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立卫生部临床检验中心李金明Tel.010-58115053Email:[e-mail]临床基因扩增检验实验室的设计依据：卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）临床标本的接收通常的工作流程：标本采集血清分离编号保存或检测应在四个测定区域之外的地方或区域内接收接收的标本应收集在原始容器中在核酸提取时带入至标本制备区理想的PCR实验室设置A产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区理想的PCR实验室设置B门试剂准备区标本制备区扩增区产物分析区外走廊门门门门试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区外走廊门门门门AB试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门门空气流向空气流向空气流向走廊走廊试剂准备区标本制备区扩增和产物分析区空气流向空气流向空气流向其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室门试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门空气流向空气流向+空气流向++走廊走廊试剂准备区标本制备区扩增和产物分析区空气流向空气流向+空气流向++其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室空气流向临床PCR实验室设计的一般原则各区独立注意风向因地制宜方便工作“十六字口诀”产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗实验室质量管理体系的建立质量手册质量体系程序文件标准操作程序(相关记录表格)质量管理的内涵写你所做的做你所写的记录你已做的分析你已做的临床PCR实验室质量管理的特点“无基因”概念实验室要有严格的人员进入限制和程序使用合格的试剂和消耗品质量体系文件的编写实验室“质量体系”:是指实验室实施质量管理所需的组织结构、程序和资源。设计质量体系和编写质量体系文件的基本原则:就是“最有效和符合实际”质量体系文件的三大特性法规性、唯一性和适用性。法规性:是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规定的程序进行。唯一性:则是指（1）一个实验室只能有一个质量体系文件系统；（2）一项检验活动只能有唯一的操作程序；（3）一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；（4）只能使用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能使用。适用性:是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件进行修改。怎样编写SOP？XXX单位XXX实验室XXX标准操作程序编号：启用日期：版本：第页共页一目的：二适用范围：三职责或责任人：四（方法原理）五（检测设备和试剂）六（所需的环境条件）七操作步骤：1．2．3．五、本操作程序变动程序：六、相关的文件七、相关的记录表格和报告编写人审核人批准人实验室清洁SOP要点目的:为了使实验室台面、地面和仪器设备在使用后，处于洁净和无感染性状态，以防止出现因仪器设备不洁影响检测或仪器使用寿命；防止因实验室台面、地面和仪器设备的生物传染危险性造成实验室人员感染，以及防止实验室交叉污染而出现假阳性结果等。适用范围应包括实验室地面、台面和仪器设备等的清洁。按实验室台面、地面和仪器设备分开来写各自的具体清洁方法，要具体而又有可操作性应规定工作人员在清洁时，必须按试剂准备区标本制备区扩增(及产物分析)区方向进行，不得逆行规定每一工作区域的清洁必须使用专用的清洁用具，不得混用规定有潜在生物传染危险性材料溅出时的消毒清洁方法生物安全防护SOP要点明确规定实验室工作人员在进行哪一类接触到有潜在生物传染危险性的物品和材料时，应使用哪类个体生物安全防护设备和用具制定实验室内锐器物品的使用规则制定发生意外如手指划破、血清溅入眼内等情况下的处理程序明确有潜在生物传染危险性的废弃物（包括废弃临床标本）拿出实验室前的消毒方法如高压或化学消毒仪器设备的维护和校准SOP责任人维护和校准的基本方面：光路、滤光片、波长、加热模块的清洁、具体的校准点选择（如加样器的校准体积点选择、温度计的校准温度点选择等）、维护和校准的具体方法包括用具校准合格的判断标准维护和校准的间隔时间仪器设备的操作SOP按照每台仪器设备的使用说明书，将其详细操作步骤包括开机关机次序、编程、调试、运行、计算等按实际使用中的先后顺序逐项列出，最后还应有使用的注意事项。临床标本的采集、运送、接收和保存SOP特定标本采集的具体方法步骤明确规定标本的采集容器要求明确标本的采集量明确标本采集后送到实验室检测所能容许的最大时间间隔，亦即标本采集后，应在多长时间内送至实验室明确标本采集后，在送至实验室检测前的保存方式和条件明确标本从采集处运送至实验室过程中所要求的运送条件明确标本接收时，签收的程序、拒收的标准和标本唯一编号的规则规定标本在实验室内的短期（应有具体时间）和长期（应有具体时间）保存条件和要求制定保证标本安全，即如何防止标本丢失、掉换、变质的措施试剂和消耗品的质检SOP试剂质检的基本方面，如试剂的抗干扰能力（主要是针对提取试剂），即对溶血、脂血标本扩增抑制作用的了解。可通过自行制备含已知量病毒核酸的不同程度溶血或脂血的标本进行质检。如为定量检测试剂，还应包括检测的重复性、线性范围等的质检，通常使用2-3份样本进行检测即可。如为定性检测试剂，则应重点考察测定下限，可用系列稀释的含已知量靶核酸的血清标本进行核酸提取用离心管质检的基本方面带滤心吸头的质检主要是滤芯的密封性项目检测、结果判断、解释和报告SOP标本进入实验程序后的操作编号方式根据所用试剂盒确定的详细操作流程仪器编程及文件名的编写规则结果判读的流程和规则结果分析解释的流程结果报告流程实验记录及其管理SOP日常检验过程中应记录的基本内容的规定，如仪器设备操作、维护和校准过程及有关数据；检验试剂来源和批号；检验标本的来源和唯一编号；试剂的配制；实验环境条件的控制记录；实验室清洁的记录；质控的记录；原始检测数据及其推导记录等对实验记录者的签名方式的规定和要求实验记录管理的基本方面：指定专门的管理人；有专门的保存处如柜子等；记录的登记归档方法；记录的借阅及销毁记录；记录保存的时间；电子记录的备份保存具体方法及保存时间等室内质量控制SOP明确室内质控物（阳性和阴性）的来源及浓度明确所选用的质控方法明确失控的判断标准或所采用的失控规则明确失控后的分析及处理措施阳性质控样本测定结果偏低或为阴性结果偏低阴性临床标本中无强阳性临床标本中有较强阳性临床标本中有阳性临床标本全为阴性观察临床标本情况所用离心管含抑制物Taq酶活性降低核酸提取试剂效率低更换进口离心管更换Taq酶再检测更换核酸提取试剂所有标本重新检测核酸提取中靶核酸丢失核酸提取中抑抑物残留核酸提取试剂混入扩增仪孔间温度差异随机误差检测质控样本及3~5份已知阳性样本质控样本测定正常且阳性样本有些值增加质控及已知阳性样本测定仍异常按系统误差途径分析重新提取或已知浓度DNA在同一孔内扩增结果正常结果仍低进行扩增仪孔温度校准后再检测Taq酶或逆转录酶失活阴性质控样本测定为阳性临床标本亦全为阳性临床标本中有阳性也有阴性扩增产物“污染”试剂“污染”同时检测的标本情况扩增产物轻度“污染”标本间交叉“污染”3~5空管室内静置5~8份水样本检测试剂直接扩增检测验证验证5~8份水样本检测暂停日常检验，实验室清洁、通风更换试剂措施有阳性，则确认有实验室“污染”无阳性，说明为标本交叉“污染”改善操作措施参加室间质量评价SOP明确规定室间质评样本的接收记录方式、保存条件及实验编号规则明确室间质评样本的检测流程，要强调的是，室间质评样本应以与临床标本相同的方式处理和检测明确室间质评样本的报告流程，即填写、复核和签发如何进行，由谁负责明确对返回结果的分析流程和责任人明确室间质评检测失败的原因分析流程明确如果测定准确性出现问题后，如何针对性采取措施的流程投诉处理SOP明确投拆第一接触人对投拆的处理流程，即如何记录、如何针对相关投诉的进一步处理程序、是否需要报告和如何报告、以及如何向投拆人返回处理意见等。可将投拆分为不同类如对检验结果正确性、服务态度、报告单填写错误等分别编写处理流程投拆有效时的如何改进和采取何种措施的具体流程。应非常具体并具有可操作性临床PCR检验流程记录表检验日期检验项目：扩增仪中保存文件名：使用说明：1．本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。2．各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。3．本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内生物安全柜的滤膜在使用有效期内消毒溶液在有效期内冲眼器内无菌生理盐水在有效期内离心管、带滤心吸头已经过质检合操作者：试剂准备区（1区）实验前：打开通风设备实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱温度：冷藏室（2~8℃）℃；冷冻室（18℃2℃）℃实验室温度：℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度：（允许范围：30%~70%）PCR试剂来源：（可直接列出有关厂家名称）批号：检验项目：本次实验用量：人份，剩余量：人份。其他有关试剂配制：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制1%含氯消毒液毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制4％NaOH溶液毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制毫升；其他：仪器设备使用：离心机：正常不正常振荡器：正常不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外照射30分钟以上。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：标本制备区（2区）实验前：打开通风设备实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱（柜）温度：冷藏室（2~8℃）℃；冷冻室（18℃2℃）℃实验室温度：℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度：（允许范围：30%~70%）阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：1917252101826311192741220285132129614223071523318162432核酸提取及加样过程：按XXX（列出编号）SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜：正常不正常恒温仪温度校准：℃离心机：正常不正常振荡器：正常不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：扩增及产物分析区（3区）实验前打开通风设备实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）实验室温度：℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度：（允许范围：30%~70%）扩增仪操作：开机自检及运行正常按XXX（列出编号）SOP进行编程、参数设定标准曲线计算值：Slope值：（）Intercept值：（）r值：（）室内质控结果：结果：□填写室内质控记录、描质控图是否失控：□否□是实验结果：见所附扩增仪打印结果实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按XXXSOP