开题报告

本科毕业论文（设计）开题报告中文题目多克隆抗体制备及酶联免疫法测定外文题目PreparationofPolyclonalAntibodyAndEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay学号0707040009姓名学院生命科学学院专业生物技术指导教师完成时间2009-11-6生命科学学院二○○九年课题：多克隆抗体制备及酶联免疫法测定目录课题：多克隆抗体制备及酶联免疫法测定....................................1一．项目的立项依据...................................................................11．研究意义..................................................................................................12．国内外研究现状......................................................................................2二．项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题.......21．研究内容..................................................................................................22．研究目标..................................................................................................33．拟解决的关键问题..................................................................................3三．拟采取的研究方案及可行性分析.......................................31．相关研究方法及关键技术......................................................................32．技术路线..................................................................................................33．项目可行性分析......................................................................................4四．本项目的特色与创新之处...................................................4五．研究工作计划及预期研究结果...........................................5六．毕业论文（设计）提纲.......................................................5参考文献............................................................................................7附：毕业论文开题报告审核意见....................................................9课题：多克隆抗体制备及酶联免疫法测定第1面课题：多克隆抗体制备及酶联免疫法测定一．项目的立项依据1．研究意义1)全球食品安全形势不容乐观，食品安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题食品安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题，作为WTO的新成员，我国与世界各国间的贸易往来目益增加。食品安全已经成为影响农业和食品工业竞争力的关键因素，并在某种程度上制约了我国农业产业结构和食品工业的战略性调整。目前，全球食品安全形势不容乐观，主要表现为食源性疾病、恶性食品污染不断上升和部分食品生产加工新技术与新工艺带来新的危害，给人体健康带来了长期和严重的潜在健康危害。因此，保障食品的安全对国计民生具有重大意义。2)建立相关的检测技术平台对食品安全的有效监控、破除国外的一些技术壁垒和扩大我国农副产品的出口意义重大。当今食品安全日益受到各方关注，其中农副产品中的农药残留成为最受关注的热点问题之一。农药残留是指农药使用后残存于食品中的微量农药原体、有毒代谢物和杂质的总称。为了促进动物生长，预防动物的各种传染病、寄生虫病的发生，越来越多的激素类药、抗菌药、抗寄生虫药，常常被用作饲料添加剂，以小剂量长期喂养禽畜水产等动物，导致肉类食品中的兽药残留超标现象日益严重。目前，农药残留已成为我国人民膳食的主要食品安全问题，也是影响我国农产品出口的一个重要因素[1]。欧美等许多国家对进口食品中抗生素、激素和毒素等的残留均有严格的限量要求，并以此限制农副产品的进口。在此背景下，除了国内有关部门出台相应的行政监控措施，与之相关的检测技术的建立与应用才是解决问题的核心所在。因此，建立相关的检测技术平台对食品安全的有效监控以及破除国外的一些技术壁垒和扩大我国农副产品的出口意义重大[1]。3)金霉素对人体健康的危害及建立金霉素的检测技术的意义金霉素被广泛用于畜禽生产中，它们具有广谱、高效的特点，可以和大多数药物和饲料添加剂混用，在喂养过程中较稳定，药效不会降低。使用此类药物存在药剂用量过大、用药时间过长、滥用药物以及不遵守休药期提前屠宰等问题，造成其在食品中的残留，成为潜在的食品安全隐患[2]。江西师范大学2010届本科毕业论文开题报告第2面金霉素药物主要以原型经肾小球过滤排出，残留药物能沉积于骨及牙组织内，与新形成的骨、牙中所沉积的钙相结合。导致牙齿持久成黄色，甚至使出生的幼儿乳牙釉质发育不全并出现黄色沉积，引起畸形或生长抑制。金霉素药物还在肝组织中富集，造成肝损害，引起过敏反应、二重感染、致畸胎等作用。因此，建立金霉素的检测技术对确保食品安全、保障人民身体健康扩大我国农副产品的出口具有重大意义。本实验制备了金霉素完全抗原，在免疫动物后获得了多克隆抗体，通过间接酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定其效价，为金霉素残留的检测打下基础。2．国内外研究现状金霉素是四环素类抗生素的一种，近年来被广泛用于畜禽生产中，其在食品中的过量残留给我国整个产业发展和食品安全保障带来了挑战。建立一项高技术化、系列化、速测化、便携化的金霉素检测方法显得特别重要。金霉素的检测方法有荧光法[4]高效液相色谱法[5-7]、液相色谱-质谱联用法[8]、微生物法[9]等。目前，我国进出口食品中四环素类的残留检测采用的是高效液相测定法，这种方法对被测样品的前处理要求高，检测的灵敏度不够高[10]-[11]。荧光法、微生物法等方法对待测样品的前处理要求高，且烦琐、费时、易受到其它抗生素的干扰，常缺乏专一性和精确度。免疫学方法具有快速、敏感性强[12]、特异性高[13]等特点，针对此类小分子半抗原，目前比较常用的ELISA检测(包括多数试剂盒)一般是在间接法检测抗体的基础上结合竞争法来实现的，即间接竞争ELISA法[14](也有称为抑制性测定法[17])。二．项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题1．研究内容1)金霉素抗血清的制备a)戊二醛法合成金霉素完全抗原采用戊二醛做交联剂，使牛血清白蛋白(BSA)载体和小分子半抗原金霉素的氨基以共价键连接合成免疫完全抗原[18]。b)免疫程序及血清纯化按免疫程序对日本大白兔进行免疫。免疫期间采用免疫沉淀实验[19]检测抗体效价。采用颈动脉插管收获抗体，辛酸法—DEAE纤维素纯化抗血清[20]。2)金霉素特异性抗体的鉴定及其效价测定a)重氮法[21]合成金霉素包被抗原。课题：多克隆抗体制备及酶联免疫法测定第3面b)间接酶联免疫吸附法鉴定金霉素特异性抗体的存在，并测定其效价。3)金霉素特异性抗体亲和力的测定4)金霉素标准曲线的建立2．研究目标通过综合运用所学的理论知识和技能，解决多克隆抗体制备和酶联免疫法检测小分子半抗原方面的实际问题，从而对小分子半抗原检测有较深刻的了解，对生物技术手段在生产生活中应用有较深刻的认识，为今后独立从事相关领域工作打下基础。3．拟解决的关键问题1.采取合适方法制备出对金霉素亲和力强的抗体，是建立灵敏的ELISA检测方法的基础[22]。2.先进的抗原固相化技术将抗体固定在免疫反应板上是建立ELISA检测方法的前提。3.抗原、抗体结合的亲和力常数受pH值、离子强度、有机溶剂等因素的影响，因此应为抗原抗体结合提供适当的环境。三．拟采取的研究方案及可行性分析1．相关研究方法及关键技术1.戊二醛法合成金霉素完全抗原2.免疫沉淀实验检测抗体效价3.颈动脉插管收获抗体，4.辛酸法—DEAE纤维素纯化抗血清5.重氮法合成金霉素包被抗原6.间接酶联免疫吸附法鉴定金霉素特异性抗体的存在，并测定其效价2．技术路线加底物显色抗体酶标抗原固相抗原江西师范大学2010届本科毕业论文开题报告第4面3．项目可行性分析1.本研究有科学的理论依据酶免疫技术是60年代在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的新技术。1966年以Engvall、Perlmann和Schurs为先驱，发展了酶免疫测定方法，到1971年Engvall和Perlmann首次将抗体上的酶标记用于兔球蛋白上代替在免疫分析法中应用的常规放射标记，他们所做的以酶为基础的免疫分析法(称为酶联免疫吸附分析法，ELISA)的灵敏度与放射免疫分析法相同。但是和放射免疫分析法不同，酶法简便、本质上安全而且不需要用到昂贵的闪烁计数器。这一实验技术的建立被认为是目前令人瞩目的有发展前途的一种新技术。此后，DeWasch等用ELISA研究了猪肉和鸡肉中的四环素类药物残留，能够检测到的四环素类药物的最低水平是欧洲的MLR值。研究结果表明半定量ELISA方法可靠。能被用来预测活猪组织中的四环素类药物的残留。酶免疫方法是以抗体和抗原的特异性结合为基础的，同时利用标记物的酶催化底物的显色反应来反映抗原抗体结合的过程，将酶催化底物反应的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。主要特点有抗原或抗体吸附到固相载体的表面仍保持其免疫活性；抗原或抗体与酶结合所形成的酶标抗原抗体复合物仍保持其免疫活性和酶的催化活性；引入固相抗体，使游离的酶标抗原或酶标抗体与酶标抗原抗体复合物分离。当固相载体上的酶标抗原抗体复合物遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或还原，产生有色物质，颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比。因此，本研究的提出是有科学依据的。2.研究所采取的方法是切实可行的本课题利用戊二醛法合成金霉素完全抗原，免疫日本大白兔获得抗血清，是多克隆抗体制备的常用方法。重氮法合成包被抗原等技术本实验室已有较丰富的经验。因此，本课题研究所采取的方法是可行的。3.具有较好科研平台本研究所用的各种试验设备，包括紫外扫描仪、真空冷冻干燥机、酶标仪等相关研究设备南昌大学中德联合研究院都已具有，能够顺利开展试验。四．本项目的特色与创新之处目前，四环素类小分子半抗原检测的方法主要有荧光法、液相色谱法、微生物法、放射免疫法、酶联免疫法等。其中气相色谱法和液相色谱法两种方法有着精密度较高、结果可靠等优点，但因为其处理过程复杂，耗费时间长，成本较高，仪器要求条件苛刻，分析速度慢等诸方面因素限制，不适合用于大规模的样品检课题：多克隆抗体制备及酶联免疫法测定第5面验和测试。生物法容易受到干扰，灵敏度不高。而放射免疫法容易造成放射污染，不易操作。酶联免疫法有灵敏度较高，易于操作，且适合大规模筛选的特点，所以该方法有推广价值和实用价值。五．研究工作计划及预期研究结果时间研究内容第一周第一次免疫、采血第二周第二次免疫、采血第三周第三