实验六血清ALT活性测定1

实验六血清ALT活性测定一、何谓ALT？谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase，GPT）丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase，ALT）复习：反应式大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。二、ALT催化的化学反应:丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT三、ALT的分布:主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等，血清中的含量很低。病变时，细胞受损，血清ALT含量升高。四、ALT测定的临床意义：作为（肝脏）疾病诊断和预后判断的指标之一。五、测定血清ALT的方法：King法（金氏法）Reitman法（赖氏法）Mohun法（穆氏法）1981年全国生化检验方法学讨论会确定用赖氏法（改良）作为临床首选，单位为：卡门氏单位。实验六血清ALT活性测定---改良赖氏法一、实验性质：分析性二、目的及要求1、掌握ALT测定的原理及临床意义2、熟习测定的操作方法。丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT（血清）基质液在一定反应条件下(pH7.4，37℃),作用30min：三、原理：α-酮戊二酸丙酮酸+2,4二硝基苯肼α-酮戊二酸-2,4二硝基苯腙丙酮酸-2,4二硝基苯腙两者在碱性条件下呈红棕色，等摩尔浓度条件下，丙酮酸OD值大a-酮戊二酸3倍。四、试剂：省略2、按下表操作：加入物（ml）对照管(B)测定管(U)血清0.10.1基质缓冲液—0.5混匀，37℃水浴30min（准确记时）2,4—二硝基苯肼溶液0.50.5基质缓冲液0.5—混匀，37℃水浴20min；各管加入0.4MNaOH5.0ml，室温放置10min；在波长505nm处，以蒸馏水校正零点，读取各管吸光度；根据(AU--AB)标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。1、将基质缓冲液和血清在37℃水浴箱预温5min。五、操作步骤：3、标准曲线的绘制：管号01234磷酸盐缓冲液（ml）0.100.100.100.100.10丙酮酸标准液（ml）—0.050.100.150.20基质缓冲液（ml）0.500.450.400.350.30相当于酶活性（卡门氏单位）—285797150各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml，混匀，37℃水浴20min；各管加0.4mol/LNaOH溶液5.0ml，混匀，室温放置10min。波长505nm处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度；各管读数均减去0号管吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性单位作图即成标准曲线。六、结果分析：正常参考值：5～25卡门氏单位七、注意事项：1．一般血清标本内源性酮酸很少，血清对照管吸光度读数接近试剂空白管(以0.1ml蒸馏水或生理盐水代替血清，其它和对照管同样操作)，所以大批标本测定时，一般不需要每一标本都作血清对照管，以试剂空白管代替即可。但建议对超过正常的标本进行复查，复查时每份标本应作对照管。2．严重脂血症或黄疸、溶血的血清可能会引起测定管吸光度增加，因此检测此类标本时，应作血清对照管。3．赖氏法原法标准曲线只到97卡门氏单位，直线关系很好。超过此活力的标本应稀释后再测，临床上应用甚为不便，故卫生部临检中心推荐法建议标准曲线延长到150卡门氏单位，实际已不完全成直线了，只能大致反应酶活性的大小、当血清标本酶活性超过150卡门氏单位时，应将血清用生理盐水或缓冲液稀释5倍后再进行测定。4．加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分振荡混匀，否则会影响重复性；加氢氧化钠溶液方法要一致，不同方法也会导致吸光度读数的差异。5．基质缓冲液和2,4-二硝基苯肼溶液配制必须准确，每次测定时空白管吸光度上下波动不应超过0.015，如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。八、实验报告：九、思考题：1、实验目的及要求：2、实验原理：3、材料与方法：只写自己所完成的操作4、实验结果：原始结果、计算结果、标准曲线5、体会：结合具体情况