血清谷丙转氨酶活性的测定

赖氏法测定血清谷丙转氨酶活性(ALT)【目的要求】1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。【实验原理】ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移,生成丙酮酸和谷氨酸,在37℃,pH7.4,经30min反应之后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应,并与反应中的二种α-酮酸生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显红棕色,于波长505nm处读取A值。两种苯腙的吸收光谱曲线在500~520nm处差异最大,丙酮酸苯腙的呈色强度是α-酮戊二酸苯腙的3倍,据此可以计算出丙酮酸的生成量,后者与血清中的ALT的活性浓度成正比。【实验原理】丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT2,4-二硝基苯肼α-酮戊二酸-2,4-二硝基苯腙丙酮酸-2,4-二硝基苯腙0.4mol/LNaOH红棕色红棕色（三倍）卡门单位:1ml血清在25℃,340nm,体积为3ml,光径为1cm每分钟光密度下降0.001的酶量。1、主要器具微量移液器【实验仪器】可见分光光度计【实验试剂】1．0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）2．基质缓冲液精确称取D-L-丙氨酸1.79g,α-酮戊二酸29.2mg,先溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液约50ml中,用1mol/LNaOH调pH至7.4,再加磷酸盐缓冲液至100ml,每升底物缓冲液中可加氯仿防腐,4℃保存。3．1.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液4．0.4mol/LNaOH溶液5．2.0mmol/L丙酮酸标准液6．待测标本:病人血清或质控血清。【操作步骤】（1）待测血清的测定加入物(ml)对照管测定管血清0.10.1基质缓冲液0.5混匀，37℃水浴30min2，4-二硝基苯肼溶液0.50.5基质缓冲液0.5混匀，37℃保温20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.0混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”【操作步骤】（2）校正曲线的制备加入物(ml)012340.1mol/L磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.12.0mmol/L丙酮酸标准液00.050.100.150.20基质缓冲液0.500.450.400.350.301.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.5混匀，37℃保温20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.05.05.05.0卡门单位0285797150混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”取7支试管，按下表操作卡门单位0285797150加入物(ml)对照管测定管01234血清0.10.1基质缓冲液0.5混匀，37℃水浴30min0.1mol/L磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.12.0mmol/L丙酮酸标准液00.050.100.150.20基质缓冲液0.500.450.400.350.301.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.50.50.5基质缓冲液0.5混匀，37℃保温20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.05.05.05.05.05.0混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”【实验结果】1.校正曲线的制备以标准管各管的A值-“0”号管的A值,所得差值与对应酶卡门氏单位作图,即成校正曲线。2.测定管测定管A值-对照管A值,根据所得差值，从校正曲线查得标本中ALT的卡门氏单位。参考值范围：5-25卡门单位【注意事项】1.血清和底物应于37℃水浴后操作,最好置37℃水浴箱中操作。以一定时间加入，各管即时混匀,以第一管开始计时,准确反应30分钟,各管加入时间间隔一致,保证每管反应时间均为30分钟。2.加入2,4-二硝基苯肼溶液后,应充分混匀,使反应完全。3.加入NaOH溶液的方法和速度要一致,如液体混合不完全或加入速度不同均会导致吸光度的差异。4.底物和显色剂均为呈色物质,称量必须很准确。5.呈色的深浅与NaOH的浓度也有关系,其浓度越大呈色越深,但其浓度0.25M时,吸光度下降变陡,因此浓度要准确。【方法学评价】1.重复性差1)由于限制了α-酮戊二酸的用量。使生成量与酶活性不能呈现良好的线性关系。2)2,4-二硝基苯肼在碱性条件下也能显色,为了降低试剂空白的吸光度而不得不使用低浓度的2,4-二硝基苯肼,此种水平的苯肼仅能与反应体系中的两种酮酸的一半反应。3)产物旁路效应：丙酮酸在LDH的催化作用下的消耗。【方法学评价】2.准确性差：线性范围狭窄,尽管标本采用稀释后测定,但偏差仍较大。3.试剂稳定性差4.操作简单【临床意义】肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。1.ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死。2.中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞。3.轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。