细胞体外培养的基本方法和过程

体外培养的原理与技术薛庆善主编广西医科大学组胚教研室何少健电话：[phone](办)课程安排及进度实验课时间：从第14周开始实验课地点：104馆三楼东边注意事项：1.网上没有名字的同学请不要填报实验课名单。2.现在不能确定自己时间的同学不要填报，可以下次上课时再报。3.一旦填报就不能再更改时间。体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法二、体外培养的基本方法和过程植块（explant）：从动物体内取出，用于培养的小块组织一般称为外植块或简称植块。分离（散）细胞［isolated（dissociated）cell］：由组织块分散后制成的单个细胞一般称之～。细胞悬液（cellsuspension）：单个细胞分散存在于培养液或者其它平衡盐溶液、缓冲溶液中，就称之～。几个名词和概念：当培养物的总体积不断扩大，培养过程持续到一定的时候，原先的培养器皿已不能满足培养物的空间要求，这时就需要将培养物分成若干小的部分，继续培养。因此，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为原代培养或称初代培养（primaryculture）和继代培养（secondaryculture)或称再培养（subculture）两大类。二、体外培养的基本方法和过程几个名词和概念：（二）继代培养（三）体外培养的基本方法和技术（四）培养物的冻存与复苏（五）培养物的污染（一）原代培养二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）二、体外培养的基本方法和过程原代培养，通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。原代培养的概念包含以下几方面含义：①原代培养的实质就是初次培养，即培养物一经接种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养物的生长器皿；②原代培养中的“代”并不是指细胞的“代”数，原代培养物中的细胞在接种之后并不一定没有分裂增殖。相反，在原代培养过程中，培养物中的细胞也可能经历多次的细胞分裂活动而产生多个子代细胞；③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿，像盖玻片培养法和悬滴培养法，即便在换液过程中更换培养器皿，但不更换培养组织细胞所附着的生长基质盖片，仍属于原代培养；④植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需要分割培养物为较小的部分再培养。二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）１、取材及培养材料的制备２、分离（散）细胞的方法３、接种与培养过程４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）（1）准备工作：（2）制备基本步骤（技术路线）：主要是取材器具、用品的灭菌以及实验者、实验动物的清洁与消毒。１、取材及培养材料的制备：二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）大块组织洗去血污剔除多余成分切成约1mm3大小的植块植块培养•将所取组织剪碎•蛋白酶溶液消化•机械方法吹打组织块•不锈钢网筛过滤•过滤液离心•用培养液悬浮成细胞悬液•计数并调节细胞密度•培养分离的细胞二、体外培养的基本方法和过程（2）基本步骤（技术路线）：（一）原代培养（primaryculture）１、取材及培养材料的制备：二、体外培养的基本方法和过程关于取材：（1)取材要准确：取材是体外培养工作的开端。如果在这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个体外培养过程就很难达到预期的目的。(2)关于取材及制备培养材料的步骤：就动物不同组织的取材而言，取材的步骤大同小异。但在具体操作过程中，还需要根据具体的实验情况做一些调整。（一）原代培养（primaryculture）１、取材及培养材料的制备２、分离（散）细胞的方法３、接种与培养过程４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）（1）机械解离细胞法：1）吸管吹打法--2）过筛法--（2）酶学解离细胞法：1）胰蛋白酶离解细胞法--2）胶原酶离解细胞法--（3）螯合剂解离细胞法：常用螯合剂：乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na）、柠檬酸钠、枸橼酸钠。二、体外培养的基本方法和过程２、分离（散）细胞的方法：（一）原代培养（primaryculture）１、取材及培养材料的制备２、分离（散）细胞的方法３、接种与培养过程４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）３、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程接种（seeding）也称种植(plating)或体外移植(explantation),实际上就是将取材并切割好的组织块（植块）或者分离好的细胞悬液加到培养器皿内的过程。如果将准备好的植块（包括器官型植块）接种并进行培养，就称为植块培养。体外移植的称谓较多用于植块培养的情况。如果将所制备的细胞悬液用于种植和培养，就称为分离（散）细胞培养。（一）原代培养（primaryculture）３、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程分离（散）细胞培养的细胞如果属于贴壁依赖型细胞，在培养瓶皿中必须黏附于一定的生长基质表面才能生长，这样的细胞一般只能在培养瓶皿表面长满一层，当培养物长满培养器皿的表面时即会因为接触抑制而停止生长，这种培养方式就称为单层细胞培养（single-layercellculture)。如果所培养的细胞没有贴壁依赖性，在悬浮状态下即可以生长和繁殖，这样的培养方式就称为悬浮（细胞）培养（suspensionculture）。（一）原代培养（primaryculture）３、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（1）植块培养：植块培养是比较简单的培养方法，其技术要点就是将从动物体内所取得的组织切割成一定大小的植块，再将植块接种到培养瓶皿内，加入培养液，然后将培养瓶皿送入培养箱中进行培养。植块培养的目的主要有两个，其一是观察植块的组织学生长行为，其二是通过植块培养，让构成植块的细胞从植块内迁移出来并在植块外分裂增殖，然后将植块去除，从而得到细胞培养物。（一）原代培养（primaryculture）３、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（2）分离（散）细胞培养：相对于植块培养法，分离（散）细胞培养的最大优点是：解除了植块内细胞之间的“组织关系”，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。借助分离（散）细胞培养法，还可以分离(isolate)或纯化某一类型的细胞，从而实现对单一细胞类型（monotypiccellculture）进行细胞生物学研究。动物组织的大多数细胞类型都属于贴壁（锚定）依赖型细胞（anchorage-dependentcell)。（一）原代培养（primaryculture）３、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（3）生长基质：生长基质（growthsubstratum）泛指培养物附着的各种介质，狭义特指在塑料或玻璃培养器皿表面上涂布（包被）的一层能够促进培养物黏附、贴壁与铺展的生物活性物质。一般来说，国际上一些著名厂商生产的塑料或玻璃培养器皿，其使用的材质能够适宜大多数种类的动物细胞体外生长。只有少数黏附和贴壁能力较差的细胞，需给予提供包被有特殊生长基质物质的生长表面。（一）原代培养（primaryculture）３、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（4）悬浮细胞培养（suspensioncellculture）对于有些细胞来说，其生长不需要黏附在某一固相表面便能分裂增殖。例如，某些白血病细胞、某些腹水瘤细胞等。体外培养这种细胞时，可以通过对培养液以及其中的细胞进行不断搅拌，或对培养器皿进行振荡、快速旋转而维持细胞的悬浮状态。也有一些细胞无须搅拌或用摇床摇动，只要在培养器皿表面涂布一层不利于细胞粘附的硅脂即可维持悬浮状态。这种培养方法就称为悬浮细胞培养。（一）原代培养（primaryculture）１、取材及培养材料的制备２、分离（散）细胞的方法３、接种与培养过程４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程随着培养的进程，营养物被消耗，细胞的代谢产物愈来愈多，尤其是细胞呼吸反应，释放出的CO2及其它酸性代谢产物（如乳酸和丙酮酸）越来越多，培养液的pH值越来越低，培养液的颜色越来越黄。根据培养液的颜色变化确定换液的间隔时间是很有实际意义的。营养物质消耗的快慢还取决于所接种的细胞数量。随着培养过程的继续，细胞会分裂增生，数量增加，换液的时间间隔就可能越来越短。（一）原代培养（primaryculture）二、体外培养的基本方法和过程5、原代细胞培养方法的注意事项（1）关于培养液：1)培养基的选择：培养某一种细胞，到底选用哪一种培养基，需要根据细胞的生长情况摸索确定。2）添加物：选择好培养基类型以后，还要摸索需要补加的成分及其添加量。3)培养液的酸碱度：普通动物细胞一般适宜的pH范围为7.2－7.4当pH值低于6.8时，会对细胞的生长产生抑制作用。4)换液：换液时，如果细胞密度很低或者细胞的生长较为缓慢，可以不完全更换培养液，只吸出一半的旧培养液，补加相同体积的新培养液即可。培养液最好经事先预温至370C。（一）原代培养（primaryculture）二、体外培养的基本方法和过程5、原代细胞培养方法的注意事项（2）关于培养空间：培养空间是指培养物生存的空间，包括液相环境与气相环境两方面。调整培养空间的主要目的是改变对培养物的供氧量。一般来说，培养液与液面上的空间二者之间的体积比例以1：10为宜。加入的培养液液面高度最好维持在2～5mm的范围。（一）原代培养（primaryculture）二、体外培养的基本方法和过程5、原代细胞培养方法的注意事项（3）其它方面：必须根据不同细胞生命力的不同以及对环境转变适应能力的不同，选择适宜的取材、分散、种植方法和选用适当的培养条件。除了所培养细胞自身的活力外，原代培养不成功最大的可能性有两点：其一是在对组织分散并分离细胞的过程中严重损伤了细胞，其二是给细胞提供的体外生长环境，尤其是生长基质与培养液条件不合适。（一）原代培养（primaryculture）（二）继代培养（三）体外培养的基本方法和技术（四）培养物的冻存与复苏（五）培养物的污染（一）原代培养二、体外培养的基本方法和过程（二）继代培养（secondaryculture）二、体外培养的基本方法和过程将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。传代培养的实质就是分割后再次培养。只要是将培养物从一个培养器皿转移到另一个器皿之内继续培养就算传代。即便是按“一传一”的比例进行传代。1、原代培养物需要传代的指标2、传代的过程3、传代培养的注意事项二、体外培养的基本方法和过程（二）继代培养（secondaryculture）二、体外培养的基本方法和过程（1）植块培养物与器官培养物：植块培养物生长一定时间之后，从植块内长出（outgrowing）的细胞会越来越多，迁移出来的细胞也会不断分裂繁殖，逐渐长满所附着的生长基质表面，细胞之间逐渐发生接触性抑制现象。若不将原代培养物分割再进行培养，植块培养物可能会停止生长。1、原代培养物需要传代的指标（二）继代培养（secondaryculture）二、体外培养的基本方法和过程（2）分离（散）细胞培养物：对于贴壁依赖型细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞分裂增殖，数量愈来愈大，逐渐会在培养瓶皿的底壁形成一完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此时便需要进行传代。判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的主要指标就是观察培养物是否已基本长满培养瓶皿的底壁。1、原代培养物需要传代的指标